PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE FORMA SELECTIVA PLANTAS ESTÉRILES MACULINAS O FEMENINAS.

Un procedimiento de producción de plantas estériles masculinas o femeninas que comprende las etapas de transformar material vegetal con un polinucleótido que codifica al menos una enzima que reacciona con una sustancia no fitotóxica para producir una citotóxica y regenerar el material transformado de este modo en una planta,

en el que dicha sustancia no fitotóxica se aplica a la planta hasta el momento de la formación y/o maduración de gametos masculinos o femeninos, de modo que la sustancia no fitotóxica posibilita la producción de una fitotóxica que evita selectivamente la formación de o hace de otro modo a dichos gametos no funcionales, en el que la enzima se expresa preferentemente en estructuras reproductoras masculinas o femeninas y la sustancia no fitotóxica es un aminoácido D-alfa, caracterizado porque la enzima es una D-aminoácido oxidasa obtenida de Rhodotorula gracilis y codificada por la secuencia de ácido nucleico como se representa en SEC ID Nº: 3, siendo dicha enzima una versión mutada de la proteína codificada por SEC ID Nº: 3 y comprendiendo una lisina en la posición 58 y en la posición 213 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, Gln y Gly; en la posición 238 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, Gln y Gly y/o en la posición 223 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, Cys, Gly, Gln y/o Asn.

Procedimiento de producción de forma selectiva plantas estériles masculinas o femeninas La heterosis en plantas de cultivo puede tener un efecto notable en la mejora del rendimiento. En general, los híbridos muestran rendimientos aumentados en comparación con variedades no híbridas. Los híbridos habitualmente proporcionan una mayor unidad de retorno para factores de crecimiento tales como agua y fertilizantes. Los híbridos con frecuencia ofrecen superior tolerancia a tensión, uniformidad en producto y madurez y también proporcionan una oportunidad de reproducción sencilla para combinar características o rasgos que pueden ser difíciles de combinar de otras maneras. El vigor del híbrido en plantas es generalmente de suficiente magnitud para garantizar la explotación comercial. Los híbridos comerciales se usan de forma extensiva en muchos cultivos incluyendo maíz, sorgo, remolacha azucarera, girasol y colza. Sin embargo, debido principalmente a la falta de procedimientos de producción de semillas híbridas económicos, el trigo, cebada y arroz aún se cultivan principalmente como endogámicos.

Tradicionalmente, la producción de semillas híbridas implica plantar bloques separados de líneas parentales masculinas y femeninas recogiéndose solamente la semilla de los parentales femeninos. Para asegurar que esta semilla es híbrida, deben minimizarse la autopolinización de la línea parental femenina haciendo a la línea masculina estéril. Los procedimientos para hacer a la línea femenina parental masculina estéril incluyen procedimientos mecánicos, químicos y genéticos. En plantas dioicas, tales como maíz, la esterilidad masculina puede conseguirse fácilmente de forma mecánica por despenachado de la inflorescencia masculina. Sin embargo la mayoría de los cultivos son monoicos y el tener órganos masculinos y femeninos dentro de la misma flor hace dicha emasculación física poco práctica. Por lo tanto se han usado en ocasiones enfoques genéticos.

Los rasgos de esterilidad masculina genética que aparecen normalmente se controlan por genes nucleares en los que los alelos asociados con el fenotipo estéril generalmente se expresan de forma recesiva con respecto a lo alelos correspondientes asociados con fertilidad. Cuando se produce esterilidad masculina genética normalmente está asociada con un gen recesivo sencillo que debe ser homocigoto para que se exprese la esterilidad masculina. Para hacer uso práctico de tales rasgos de esterilidad masculina genética, los obtentores habitualmente desarrollan una línea femenina fenotípicamente uniforme que segrega en plantas estériles masculinas y fértiles masculinas. Las plantas fértiles masculinas, una vez identificadas, necesitan depurarse lo que requiere mucho trabajo. Existe siempre un problema con el mantenimiento de la línea parental puesto que las plantas fértiles masculinas no pueden eliminarse de la población debido a que son esenciales para el mantenimiento de la población. En lugar de basarse en la existencia de alelos de esterilidad masculina naturales también es posible usar procedimientos biológicos moleculares. Pueden obtenerse por ingeniería genética plantas que expresen, por ejemplo, genes antisentido o de ribozimas que disminuyen o eliminan la expresión de genes clave necesarios para la formación de polen viable. Tales líneas transgénicas de plantas son estériles masculinas y se usan para la producción de semilla híbrida usando de forma cruzada polen de plantas fértiles masculinas. El problema principal con tales líneas es que solamente pueden mantenerse en un estado heterocigoto en generaciones posteriores, mediante cruces con las líneas fértiles isogénicas. Esto puede ser un problema en la producción de semillas híbridas en la que el rendimiento es crítico. Aunque, por ejemplo ligando la resistencia a herbicida con la esterilidad masculina, puede ser posible depurar de forma selectiva las plantas fértiles masculinas esto aún necesita que las plantas se planten inicialmente a densidades muy altas.

El uso de esterilidad masculina citoplásmica para producción híbrida comercial requiere un citoplasma estéril masculino estable y una fuente de polen. El sistema genético citoplásmico de esterilidad masculina requiere la existencia de tres tipos de línea para producción híbrida, la línea A (estéril masculino citoplásmico) , línea B (mantenedora fértil masculina) y línea R (fértil masculina con genes restauradores) . Cruces de tres vías producidos con este sistema implican el mantenimiento y producción de cuatro líneas, una línea A y una B de un endogámico y endogámicos masculinos fértiles de las otras dos. La dependencia de una fuente sencilla de citoplasma estéril masculino puede minimizar la flexibilidad de cultivo y conducir a descendencia con susceptibilidad generalizada a enfermedades particulares.

La semilla híbrida también puede producirse a través del uso de agentes químicos que inhiben la formación de polen viable. Estos agentes químicos, llamados gametocidas, se usan para transmitir esterilidad masculina transitoria. Sea cual sea el gasto, la registrabilidad y fiabilidad de los gametocidas ha limitado su uso.

Un defecto de los sistemas de producción de semillas híbridas tradicionales es la necesidad de plantar filas o bloques separados de las líneas parentales masculinas y femeninas. Aquí la polinización de baja eficacia es un problema especialmente agudo en especies de cultivo, tales como trigo, que liberan cantidades pequeñas de polen que no viaja lejos con el viento. En tales cultivos necesitan dedicarse hasta dos tercios del campo productor de híbrido a plantas donadores de polen masculinas y después la producción de semilla híbrida se hace por lo tanto antieconómica.

Para conseguir producción de semilla más económica en trigo y otros cultivos es necesario mover las plantas masculinas y femeninas más cerca entre sí para una transferencia del polen más eficaz; de forma más eficaz plantando de forma intercalada machos y hembras a una distancia de centímetros entre sí en las mismas filas. En un sistema tal no sería práctico recoger solamente la semilla de los parentales femeninos (masculinos estériles) . La contaminación con semilla no híbrida que se origina del parental masculino puede minimizarse usando un porcentaje tan bajo de tales plantas parentales masculinas en la mezcla de plantación como sea posible y/o usando plantas masculinas que son estériles femeninas. Un procedimiento para construir una línea estéril femenina dominante se ha descrito (documento EP 412.006 A1 (1990) ; Goldman y col., (1994) EMBO. J., 13, 2976-2984) pero, como con las líneas estériles masculinas, la línea tiene que mantenerse como un heterocigoto.

En consecuencia sigue existiendo una necesidad de procedimientos económicos sencillos de producción de semilla híbrida. En particular, para producir de forma eficaz semilla híbrida sigue existiendo una necesidad de proporcionar tanto líneas femeninas parentales estériles masculinas como líneas masculinas parentales estériles femeninas que pueden mantenerse fácilmente como líneas homocigotas puras y que son útiles para producción de semilla híbrida eficaz. Los procedimientos que se describen en la técnica para conseguir esto incluyen procedimientos en los que se produce semilla híbrida a partir de líneas parentales masculinas y femeninas al menos una de las cuales comprende un gen quimérico heterólogo, preferentemente expresado en tejido floral, que hace a la línea condicionalmente estéril dependiendo de la aplicación exógena de una sustancia no fitotóxica que puede convertirse especifica y localmente a una fitotoxina por una enzima que se codifica por el gen quimérico heterólogo y que se expresa preferentemente en las estructuras reproductoras masculina o femenina. La sustancia no fitotóxica puede ser un proherbicida. La ventaja de tener tales líneas parentales condicionalmente estériles es que permite que se mantengan como homocigotos con respecto al rasgo de esterilidad. La fertilidad se interrumpe sólo tras la aplicación exógena de la sustancia no fitotóxica. En un ejemplo tal de un sistema de esterilidad masculina condicional un gen que codifica una enzima desacetilasa se expresa preferentemente en células del tapete de tejido de flores masculinas en el que convierte el proherbicida N-acetil L fosfinotricina aplicado de forma exógena a la fitotoxina L fosfinotricina y de este modo evita la formación de polen viable. En ejemplos similares adicionales: (i) la expresión preferente en el tapete de un citocromo bacteriano P450 catalizada la conversión de proherbicida R7402 a una fitotoxina de sulfonilurea que evita la producción de polen... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de plantas estériles masculinas o femeninas que comprende las etapas de transformar material vegetal con un polinucleótido que codifica al menos una enzima que reacciona con una sustancia no fitotóxica para producir una citotóxica y regenerar el material transformado de este modo en una planta, en el que dicha sustancia no fitotóxica se aplica a la planta hasta el momento de la formación y/o maduración de gametos masculinos o femeninos, de modo que la sustancia no fitotóxica posibilita la producción de una fitotóxica que evita selectivamente la formación de o hace de otro modo a dichos gametos no funcionales, en el que la enzima se expresa preferentemente en estructuras reproductoras masculinas o femeninas y la sustancia no fitotóxica es un aminoácido D-alfa, caracterizado porque la enzima es una D-aminoácido oxidasa obtenida de Rhodotorula gracilis y codificada por la secuencia de ácido nucleico como se representa en SEC ID Nº : 3, siendo dicha enzima una versión mutada de la proteína codificada por SEC ID Nº : 3 y comprendiendo una lisina en la posición 58 y en la posición 213 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, Gln y Gly; en la posición 238 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, Gln y Gly y/o en la posición 223 un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, Cys, Gly, Gln y/o Asn.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha sustancia no fitotóxica se aplica en mezcla junto con al menos una sustancia adicional que se selecciona del grupo que consiste en sanadores, gametocidas, inductores de glutatión-S-transferasa, inductores de citocromo P450, herbicidas, fertilizantes, nematocidas, sinergistas, insecticidas, fungicidas, hormonas, reguladores del crecimiento vegetal e inhibidores de citocromo P450.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la sustancia no fitotóxica se aplica foliarmente y es un sustrato oxidable móvil en el floema y metabólicamente estable de la enzima, en el que la enzima proporciona el producto fitotóxico, como uno directo o indirecto de la sustancia no fitotóxica.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación precedente, en el que el producto fitotóxico es uno indirecto producido en forma de peróxido y/o un anión superóxido.

5. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 ó 4, en el que la sustancia no fitotóxica es Daspartato o D-glutamato y la enzima oxida dicho aminoácido a un 2-ceto ácido con reducción conjunta de oxígeno a un anión peróxido.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior en el que el aminoácido en la posición 213 es Thr.

7. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en el que la enzima tiene una diana distinta del peroxisoma.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la sustancia no fitotóxica es el enantiómero D de fosfinotricina o un D enantiómero de bialafos.

9. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la sustancia no fitotóxica está comprendida dentro de una mezcla, que contiene una sustancia fitotóxica y en el que la enzima oxida un aminoácido a un 2-ceto ácido con reducción conjunta de oxígeno a un anión peróxido.

10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que la mezcla comprende tanto D como L fosfinotricina y el material vegetal expresa un gen de PAT sustancialmente solo en tejidos verdes y/o en tejido floral que produce gametos que son distintos de los que se hacen no funcionales.