PÉPTIDOS MIMÉTICOS DE CD4 Y USOS DE LOS MISMOS.

La invención se refiere a péptidos miméticos de CD4 optimizados derivados del péptido CD4M33 (Martin et al., NAT. Biotechnol., 2003, 21, 71-76 e International PCT Application WO 02/059146) y al uso de estos péptidos para la fabricación de nuevas vacunas y fármacos anti-VIH. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ha estado implicado como la causa principal de la enfermedad del sistema inmunitario lentamente degenerativa denominada síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). En los seres humanos, la replicación del VIH se produce de manera destacada en las poblaciones de linfocitos T CD4, y la infección por VIH conduce a la depleción de este tipo de células y, finalmente, a la inmunoincompetencia, infecciones oportunistas, disfunciones neurológicas, crecimiento neoplásico, y en última instancia, la muerte. El tratamiento para el VIH-1 incluye una combinación de compuestos anti-VIH, que tienen como diana la transcriptasa inversa del VIH (azidotimidina (AZT), lamivudina (3TC), dideoxiinosina (ddI), tenofovir, neviparina, efavirenz), o la proteasa (saquinavir, nelfinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir), y sólo un nuevo inhibidor de la fusión, enfuvirtida, ha sido recientemente aprobado (Richman, D.D., Nature, 2001, 410, 995-1001; Lalezari et al., N. Engl. J. Med., 2003, 348, 2175-2185). Sin embargo, la aparición de nuevos aislados de VIH resistentes a los fármacos existentes, además de las dificultades en el cumplimiento de los regímenes posológicos debido a la cantidad de píldoras y los efectos secundarios adversos, sugiere que se necesitan con urgencia nuevas terapias con nuevos fármacos que tengan como diana diferentes etapas del ciclo del VIH. Aunque se ha dedicado un esfuerzo considerable al diseño de una vacuna eficaz, actualmente no existe ninguna vacuna contra la infección por VIH. La partícula viral del VIH comprende un núcleo viral compuesto por proteínas de la cápside, un genoma de ARN y enzimas, rodeada por una cubierta de proteínas gag miristiladas. Esta cubierta está rodeada a su vez por una envoltura de membrana lipídica externa que comprende las glicoproteínas de la envoltura del VIH (gp120 y gp41). Las glicoproteínas de la envoltura del VIH son sintetizadas como una única proteína precursora de 160 kilodaltons, que es clivada por una proteasa celular durante la gemación viral en dos glicoproteínas, gp41 y gp120. Gp41 es una glicoproteína transmembrana y gp120 es una glicoproteína extracelular, que permanece asociada no covalentemente a gp41. Gp120 se presenta como un trímero asociado a gp41 y forma las espículas de la envoltura en la superficie de los viriones de VIH. La entrada del VIH es un proceso en múltiples etapas iniciado por la unión de la glicoproteína de la envoltura en la superficie del VIH gp120 (Env) al receptor CD4 de la célula hospedadora. Esta asociación induce cambios conformacionales en Env que permiten su unión a un correceptor de quimiocina CCR5 o CXCR4 (Wu et al., Nature, 1996, 384, 179-183; Trkola et al., Nature, 1996, 384, 184-187; Feng et al., Science, 1996, 272, 872-877). La asociación con este correceptor activa las propiedades fusogénicas de la proteína transmembrana gp41 asociada no covalentemente y la posterior entrada del virus en la célula (Wyatt R. y Sodroski, J. Science 1998, 280, 1884-1888). Cada una de estas etapas puede representar una diana potencial para nuevos fármacos (Blair et al., Drug Discov. Today, 2000, 5, 183-194; Moore J.P. y Doms R. W., P.N.A.S., 2003, 100, 10598-10602; Vermeire, K. y Schols, D., Expert. Opin. Investig. Drugs, 2005, 14, 1199-1212; Ryser H.J.P y Flückiger, R., Drug discovery today, 2005, 10, 1085-1094). E07825126 05-08-2011 La información sobre los receptores celulares implicados en la infección viral, así como sobre la estructura de la envoltura viral y su interacción con las células hospedadoras, puede ayudar a diseñar inhibidores de entrada y vacunas contra el VIH. La estructura tridimensional de la proteína "nuclear" gp120 ha sido determinada en la conformación unida a CD4 (complejo gp120HXB2:CD4:17b; código PDB 1G9m; Kwong et al., Nature, 1998, 393, 648-659; Huang et al., Science,   2005, 310, 1025-1028; Kwong et al., Structure, 2000, 8, 1329-1339) y la forma sin ligando de gp120 de SIV más recientemente publicada (código PDB 2BF1; Chen et al., Structure, 2005, 13, 197-211), pero hasta ahora no hay ninguna estructura cristalina disponible del trímero gp120. En la conformación unida a CD4, gp120 consiste en un dominio externo y uno interno unidos por una lámina- de cuatro cadenas (lámina puente), mientras que en la conformación sin ligando, aunque mantiene esta organización de dos dominios, el dominio interno es significativamente diferente y la lámina- no se forma. La unión a CD4 crea una cavidad de apenas 150 Å3, que se extiende profundamente en el interior de gp120 en la intersección entre el dominio interno y el externo, mientras que esta cavidad está ausente en la forma sin ligando. En el complejo, una gran superficie del dominio D1 (742 Å2) de CD4 se une a una gran (800 Å2) depresión conservada en gp120. La interfaz de CD4 comprende 12 residuos (posiciones 36 a 47 de la secuencia de aminoácidos de CD4 correspondiente al bucle de tipo CDR2 de CD4) que contribuyen a la unión de gp120 con interacciones de uniones H electrostáticas hidrófobas mixtas. En el complejo, la cadena lateral Phe43 de CD4 bloquea la entrada de la cavidad de gp120 (cavidad Phe43 o bolsillo Phe43) y Arg59 de CD4, justo detrás de Phe43, está implicada en un doble enlace H con Asp368 en gp120. Además de estos receptores celulares, el VIH es capaz de unirse a otras moléculas presentes en las células que infecta, como DC-SIGN, esfingolípidos o sulfatos de heparán. Se sabe que la heparina, los polisacáridos sulfatados y los polianiones en general se unen al bucle V3 de gp120 de la envoltura viral (con una preferencia por las envolturas con tropismo X4), (Harrop, H.A. y Rider, C.C., Glycobiol., 8, 131-137; Moulard et al., J. Virol., 2000, 74, 1948-1960) y a una región de gp120 inducida por CD4 (CD4i), cercana a V3, implicada en la unión al correceptor (Vives et al, J. Biol. Chem., 2005, 280, 21353-21357). La asociación entre el bucle V3 y aquellas moléculas parece dominar el efecto electrostático de esta interacción doble y probablemente se produce a través de las interacciones entre las fracciones de sulfato ácido de derivados de la heparina y los residuos básicos del bucle V3. Se sabe que los virus de tropismo X4 tienen bucles V3 más básicos (Berger et al., Nature, 1998, 391, 240-) y por lo tanto serían mejores ligandos a los derivados de la heparina. Esto no excluye una afinidad de los derivados de la heparina por el epítopo CD4i de los virus de tropismo R5, puesto que los péptidos que contienen tirosina sulfatada también pueden asociarse con esas gp120 (Farzan et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 40397-40402). La fijación a la célula es la primera etapa de la entrada del VIH-1 y una diana principal para la terapia antiviral y el diseño de vacunas. * Terapia Antiviral Se ha demostrado que diferentes macromoléculas inhiben la unión de gp120 a CD4, a partir de CD4 soluble (Daar et al., P.N.A.S., 1990, 87, 6574-6578). Sin embargo, se ha demostrado que los inhibidores potentes monovalentes de la unión CD4-gp120 como CD4 soluble son eficaces in vitro (Daar et al., citado anteriormente), pero tienen una afinidad reducida por los aislados primarios. Están surgiendo indicios de que el VIH-1 a través de los trímeros de su envoltura podría unirse a varios receptores CD4 de la superficie celular al mismo tiempo (Kwong et al., Nature, 2002, 420, 678-682). Los inhibidores multiméricos que tienen como diana varios sitios de unión a CD4 en una sola espícula o incluso en un virión podrían por lo tanto ser mucho más capaces de competir con CD4 por la fijación al virus. Ligandos multivalentes bien diseñados podrían llevar a grandes ganancias de avidez reduciendo la constante de disociación del complejo y aumentando la afinidad funcional del ligando (Gestwicki et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 14922-14933; Sadler et al., Rev. Mol., Biotech., 2002, 90, 195-229). Se han desarrollado hasta el momento sólo unos pocos compuestos multiméricos que presentan varias moléculas de CD4. Entre ellos, fueron descritos constructos complejos que presentan cuatro o doce copias de dominios de CD4 en una estructura de inmunoglobulina (Allaway et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1995, 11, 533-539; Gauduin et al., J. Virol., 1996, 70, 2586-2592; Arthos et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, 11456-11464) y llevaron a resultados prometedores como inhibidores del VIH-1 (Arthos et al., citado anteriormente; Trkola et al., J. Virol., 1995, 69, 6609-6617). La mayor estabilidad de estas moléculas y la posibilidad de que puedan bloquear al mismo tiempo varias subunidades de gp120... [Seguir leyendo]

  1. Un péptido aislado, caracterizado porque comprende la siguiente secuencia (I): TPA- Asn- Leu- His- Phe- Cys- Gln- Leu- Xaaa-Cys- Lys- Ser- Leu- Gly- Leu- Leu- Gly- Arg- Cys- Xaab-Xaac- Xaad- Xaae-Cys-Ala-Cys-Val-NH2, en el que TPA representa ácido tiopropiónico, Xaaa representa Arg o Lys, Xaab representa Ala o Arg, Xaac representa un D-aminoácido, Xaad representa Thr, Ser o Asn, Xaae representa fenilalanina o un derivado de fenilalanina con una estructura (II): donde A está ausente o representa S, O, NH o CH2, B está ausente o representa un alquilo C1 a C6 de cadena lineal o ramificado y R representa un alquilo C3 a C6, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, cicloheterocicloalquenilo, arilo o heteroarilo. 2. El péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque Xaa c es (D)prolina. 3. El péptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un derivado de fenilalanina de la estructura (II) que es una bifenilalanina. 4. El péptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque comprende un derivado de fenilalanina de la estructura (II) en la que B representa un alquilo C1 a C3 de cadena lineal. 5. El péptido según la reivindicación 4, caracterizado porque el derivado de fenilalanina de la estructura (II) se selecciona de entre el grupo que consiste en: para-ciclo-hexilmetoxifenilalanina y para-ciclo-pentiletoxifenilalanina. 6. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es de la secuencia SEQ ID NO: 3 a 6. 7. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque es un monómero. 8. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque es un multímero en el que cada péptido se une al otro mediante un espaciador de una longitud que es apropiada para la unión de los péptidos a los sitios de unión de CD4 en el complejo trimérico de la gp120 del VIH. 9. El péptido según la reivindicación 8, caracterizado porque es un dímero. 10. El péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se marca con una sonda apropiada. 11. Un compuesto antiviral multivalente, caracterizado porque comprende al menos un péptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, unido a un inhibidor de la entrada del VIH seleccionado de entre el grupo que consiste en: inhibidores de la unión correceptor-gp120 e inhibidores de la fusión virus-célula. 36 E07825126 05-08-2011 12.  El compuesto antiviral multivalente según la reivindicación 11, caracterizado porque el péptido se une a un polianión. 13. Una composición antiviral, caracterizada porque comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o un compuesto según la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en un portador aceptable. 14. La composición según la reivindicación 13, caracterizada porque comprende al menos un fármaco anti-VIH adicional. 15. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende un complejo de un péptido según cualquiera de reivindicaciones 1 a 9 y un polipéptido Env de VIH, en un portador aceptable. 16. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la purificación de la proteína Env de VIH. 37 E07825126 05-08-2011   38 E07825126 05-08-2011   39 E07825126 05-08-2011   E07825126 05-08-2011   41 E07825126 05-08-2011   42 E07825126 05-08-2011   43 E07825126 05-08-2011   44 E07825126 05-08-2011   E07825126 05-08-2011   46 E07825126 05-08-2011   47 E07825126 05-08-2011   48 E07825126 05-08-2011   49 E07825126 05-08-2011   E07825126 05-08-2011   51 E07825126 05-08-2011   52 E07825126 05-08-2011   53 E07825126 05-08-2011   54 E07825126 05-08-2011   E07825126 05-08-2011   56 E07825126 05-08-2011