PROCEDIMIENTO PARA MONITORIZAR LA EVAPORACIÓN DE UN CULTIVO CELULAR.

Procedimiento para monitorizar la evaporación de un cultivo celular SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere a un procedimiento para monitorizar la evaporación de un cultivo celular en un dispositivo de tecnología microfluídica provisto de al menos un microcanal. Se entiende por microcanal un conducto cuyas dimensiones transversales van desde 0, 1 micras hasta 500 micras.

Los microcanales forman parte a menudo de dispositivos "Iab-on-a chip" (laboratorio en un chip) y, cuando se integran en una cámara que contiene un cultivo celular, pueden muestrear continuamente el medio del cultivo celular.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las incubadoras diseñadas para cultivos celulares se suelen humidificar para alcanzar una humedad relativa del 100% y minimizar la evaporación, pero normalmente persiste una evaporación residual. Por ejemplo se ha medido una velocidad de evaporación de 4, 6 microlitros/día en un solo pozo de una placa con 96 pozos. Los pozos descubiertos que hay fuera de la incubadora presentan una evaporación mucho mayor, de hasta decenas de microlitros/hora, por ejemplo 30 microlitros/hora a 25°C y un 65% de humedad atmosférica.

Un cultivo celular es una solución acuosa y la evaporación del agua da lugar a una variación en la osmolaridad de la solución, que es una medida de la concentración de soluto. En el contexto de la presente invención dichos cultivos se emplean en ensayos de electrofisiología, que es el estudio de las propiedades eléctricas de las células e incluye medidas del potencial de membrana de la célula.

La evaporación del cultivo celular en las cámaras de dispositivos "Iab-on-achip" puede controlarse a base de cerrar herméticamente dichas cámaras, pero entonces las falta de acceso de CO2 a las cámaras impide el uso de buffers de bicarbonato para controlar el pH. Se puede mejorar la situación utilizando membranas semipermeables a gases, como por ejemplo una película de etileno-propileno fluorado, para cerrar la cámara, ya que dejan

pasar el C02 pero retienen el vapor de agua en la cámara. 5 Otra estrategia para frenar la evaporación hace uso de capas de aceite flotante en pequeños viales. Se trata de una técnica utilizada habitualmente durante la amplificación PCR (Polymerase Chain Reaction) , por ejemplo. 10 También es posible compensar los cambios en la osmolaridad del medio acuoso mediante el uso de bombas de perfusión. Sin embargo, en ausencia de datos frecuentes de retroalimentación, todas estas medidas están sujetas a desviaciones en la osmolaridad. 15 La lectura continua de la osmolaridad es crucial para realizar experimentos a largo plazo con células en dispositivos microfluídicos o de tecnología microfluídic;a, es decir, que utilizan microfluidos, que son fluidos en conductos o canales (microcanales) cuyas dimensiones transversales van desde 0, 1 micras hasta 500 micras, en los cuales el volumen del medio de cultivo es de nanolitros o microlitros. 2 O Se desprende que monitorizar la evaporación en un dispositivo microfluídico es crítico para conocer el estado del cultivo celular, ya que la evaporación residual puede afectar apreciablemente la precisión de los ensayos y la viabilidad de los cultivos. 25 3O La solicitud de patente PCT/EP2008/061584 (Enric Claverol) , presenta un aparato para registrar la actividad eléctrica producida por células in-vitro que comprende un dispositivo provisto de una estructura polimérica, la cual comprende un par de pozos o cámaras para el cultivo celular unidos por un microcanal y un par electrodos que se sumergen en dichos pozos y permiten medir la diferencia de potencial entre ellos, es decir, entre los dos extremos del microcanal. Un dispositivo de este tipo es particularmente adecuado para monitorizar la evaporación mediante un procedimiento de acuerdo con la presente invención, aunque la técnica propugnada es aplicable a una amplia variedad de dispositivos microfluídicos provistos de una estructura de microcanales. 35

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN Un objetivo de la presente invención es el de proporcionar una manera sencilla de utilizar una estructura de microcanales prevista para experimentos 5 de electrofisiología como sensor de evaporación. El procedimiento desarrollado se basa en la observación de que hay una relación entre la evaporación y la variación temporal de la resistividad eléctrica en un medio de cultivo. 10 De acuerdo con un aspecto de la invención, el procedimiento para monitorizar la evaporación comprende la etapa de registrar la impedancia entre los dos extremos del microcanal durante un período de tiempo. De este modo tan sencillo se puede aprovechar la estructura de microcanales existente en 15 numerosos dispositivos "Iab-on-a-chip" sin necesidad de introducir en ellos modificaciones destacables. Así, la medida de la evaporación resulta barata utilizando este procedimiento, ya que tampoco hay que utilizar un osmómetro separado. 2 O Además, con el procedimiento de la invención no hay que consumir la muestra (el medio de cultivo) , como sucede con los osmómetros convencionales, Y, una vez calibrado el sistema, los resultados de las medidas se pueden leer en pocos segundos, mientras que con los osmómetros convencionales hay que esperar de 60 a 90 segundos. 25 Para medir la impedancia se aplica preferiblemente una corriente alterna a través de dos electrodos dispuestos en contacto con el cultivo celular. Por diversos motivos es preferible la corriente alterna a la continua: la corriente continua polarizaría los electrodos; muchos electrodos (de, por ejemplo, Pt, 30 Au, ITa, etc) son capacitivos y presentan una impedancia muy alta en corriente continua; con corriente continua es necesario calibrar cuidadosamente el potencial de los electrodos; es mucho más fácil reducir el ruido con corriente alterna que con corriente continua. 35 En una realización el microcanal está abierto en al menos uno de sus extremos a una cámara que contiene el cultivo celular y uno de los electrodos se sitúa en dicha cámara, aunque es preferible que ambos extremos del

5 microcanal estén abiertos a sendas cámaras que contienen el cultivo celular y que cada electrodo se coloque en una cámara distinta, ya que entonces los dos electrodos se pueden simplemente sumergir en el cultivo celular y pueden reutilizarse. En una realización, al menos un electrodo está formado por un núcleo de plata con un recubrimiento de AgCI. 10 En una realización, los electrodos se seleccionan para que la capacitancia entre cada electrodo y el medio de cultivo sea al menos el triple de la capacitancia lineal entre los electrodos, ya que el hecho de que aquélla sea mucho mayor que ésta favorece la precisión de la medida de la resistencia eléctrica del microcanal. 15 2 O En una realización la frecuencia de la corriente alterna es de entre 10Hz Y 1000 Hz, preferiblemente de entre 400 Hz y 600 Hz, y más preferiblemente de entre 480 Hz y 520 Hz. En este último caso la velocidad de evaporación se estima multiplicando la velocidad de variación de la impedancia por un factor de 2, 5. En general, la velocidad de evaporación se estima multiplicando la velocidad de variación de la impedancia por un factor constante. 25 En una realización, la altura del microcanal es de entre 2 y 100 micras, en otra realización (o en la misma) la anchura del microcanal es de entre 5 y 200 micras, yen otra (o coincidiendo con alguna de las anteriores) la longitud del microcanal es de entre 0, 1 y 5 mm. 30 En una realización, la cámara es circular y tiene un diámetro de entre 1 y 10 milímetros, es decir, no es microfluídica. De todos modos, la medida o la forma de estas cámaras es poco relevante. En una realización, el microcanal forma parte de una estructura microfluídica de un material polimérico, preferiblemente PDMS. Esta estructura polimérica está preferiblemente dispuesta sobre un substrato de poliestireno. 35 En un procedimiento, para registrar la impedancia se utiliza un amplificador electrofisiológico en modo de fijación de voltaje (voltage clamp mode) . En el modo de fijación de voltaje se varía la corriente inyectada para mantener

constante el potencial de membrana.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

A continuación se describirá, a título de ejemplo no limitativo, una realización de la invención, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:

la figura 1 es una representación esquemática de un dispositivo microfluídico en el que puede aplicarse el procedimiento de la invención;

la figura 2 es una gráfica cuya abcisa es el tiempo y cuya ordenada representa dos funciones temporales:...

5 1. Procedimiento para monitorizar la evaporación de un cultivo celular en un dispositivo de tecnología microfluídica provisto de al menos un microcanal, caracterizado por el hecho de que comprende la etapa de registrar la impedancia entre los dos extremos del microcanal durante un período de tiempo. 10 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que para medir la impedancia se aplica una corriente alterna a través de dos electrodos dispuestos en contacto con el cultivo celular. 15 3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que el microcanal está abierto en al menos uno de sus extremos a una cámara que contiene el cultivo celular, y de que uno de los electrodos se sitúa en dicha cámara. 2 O 4. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que ambos extremos del microcanal están abiertos a sendas cámaras que contienen el cultivo celular, y de que cada electrodo se coloca en una cámara distinta. 25 5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que los dos electrodos se sumergen en el cultivo celular y son reutilizables. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por el hecho de que al menos un electrodo está formado por un núcleo de plata con un recubrimiento de AgCI. 30 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por el hecho de que los electrodos se seleccionan para que la capacitancia entre cada electrodo y el medio de cultivo sea al menos el triple de la capacitancia lineal entre los electrodos. 35 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por el hecho de que la frecuencia de la corriente alterna es de entre 10Hz y 1000 Hz.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que la frecuencia de la corriente alterna es de entre 480 Hz y 520 Hz.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que la velocidad de evaporación se estima multiplicando la velocidad de variación de la impedancia por 2, 5.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que la velocidad de evaporación se estima multiplicando· la velocidad de variación de la impedancia por un factor constante.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la altura del microcanal es de entre 2 y 100 micras.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la anchura del microcanal es de entre 5 y 20 200 micras.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que la longitud del microcanal es de entre O, 1 ~ 5mm.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por el hecho de que el microcanal forma parte de uné estructura microfluídica de un material polimérico.

3O 16. Procedimiento según cualquiera la reivindicación 15, caracterizado por el hecho de que dicho material polimérico es PDMS.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado por el hecho de que la estructura polimérica está dispuesta 35 sobre un substrato de poliestireno.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de para registrar la impedancia se utiliza un amplificador electrofisiológico en modo de fijación de voltaje.