Métodos y composiciones inmunoterapéuticos.

Una vesícula de fosfolípidos para producir una respuesta inmunitaria,

teniendo la vesícula de fosfolípidos una estructura de tipo cuerpo lamelar, multilamelar, y comprendiendo la composición de fosfolípidos de la vesícula de fosfolípidos:

fosfatidilcolina 44% a 60%,

esfingomielina 15% a 25%,

fosfatidiletanolamina 6% a 10%,

fosfatidilserina 2% a 6%,

fosfatidilinositol 2% a 4%

y colesterol 4% a 12%

donde las cifras representan el porcentaje en peso, teniendo la vesícula de fosfolípidos un antígeno exógeno o un poliácido nucleico que codifica un antígeno, estando adaptada la vesícula de fosfolípidos para ser fagocitada por las células presentadoras de antígenos.

Métodos y composiciones inmunoterapéuticos La presente invención se refiere en general al campo de la inmunoterapia, que son las terapias que actúan sobre o a través del sistema inmunitario. En particular, la invención se refiere a métodos y composiciones para introducir entidades químicas en células presentadoras de antígenos, concretamente células dendríticas, dando como resultado la presentación de dichos antígenos sobre la superficie de las células presentadoras de antígenos y produciendo un efecto sobre el sistema inmunitario. La invención se refiere también a las células presentadoras de antígenos modificadas resultantes y a las composiciones farmacéuticas que contienen estas células. Además, la invención describe nuevos conocimientos sobre coadyuvancia y preparaciones coadyuvantes incluyendo una serie de péptidos relacionados y vesículas de fosfolípidos que incorporan dichos péptidos.

En la actualidad existe un considerable interés en la manipulación del sistema inmunitario de los mamíferos incorporando antígenos en la superficie de las células presentadoras de antígenos en general y de las células dendríticas en particular. Al incorporar antígenos en la superficie de las células presentadoras de antígenos, se puede hacer que el sistema inmunitario se dirija a antígenos seleccionados. Esto ha sido aplicado a muchos campos terapéuticos incluyendo la terapia contra el cáncer. Muchos antígenos cancerosos han sido publicados y están siendo utilizados en pruebas en la actualidad para la inmunoterapia basada en células dendríticas humanas para el cáncer como se describe p. ej. en los documentos US 5.990.294 y 5.874.290 de Northwest Biotherapeutics, LLC.

No obstante, resulta difícil preparar células dendríticas con antígenos modificados sobre su superficie. En la técnica anterior se han considerado numerosos mecanismos. Los métodos conocidos actualmente incluyen el "pulsado" del péptido antigénico directamente sobre la superficie de la célula presentadora de antígenos o la incubación de las células presentadoras de antígenos con proteínas completas o fragmentos de proteínas que después son ingeridos por las células presentadoras de antígenos. Estos péptidos son digeridos en pequeños fragmentos por las células presentadoras de antígenos y presentados sobre sus superficies celulares. Todas estas técnicas tienen una eficacia y una reproducibilidad limitadas y hacen referencia solamente a antígenos peptídicos.

Se han publicado otros métodos. Por ejemplo, en los documentos WO96/30030 de Baxter International Inc y WO98/46785 de Dana-Farber Cancer Institute se describen métodos de fusión de las propias células dendríticas del paciente con células no dendríticas, p. ej. células cancerosas que expresan un antígeno en la superficie celular para el cual se desea obtener una respuesta inmunitaria. Dichas células se pueden hacer crecer después e inyectar en un anfitrión, cerca de su sistema linfoide, conduciendo a una respuesta inmunitaria frente al antígeno deseado. Sin embargo, este procedimiento es complejo y lento, requiriendo ingeniería genética de las líneas celulares de un paciente con el fin de incluir un gen que codifique el antígeno de interés. Además, no proporcionan un método de presentación de antígenos que no sean proteínas procesadas por la maquinaria de procesamiento de proteínas de los híbridos de células dendríticas/no dendríticas resultantes. Aún más, estas tecnologías utilizan líneas celulares cancerosas de un paciente y se requeriría un gran cuidado en la manipulación y el procesamiento de estas líneas celulares para evitar una tumorigénesis adicional. Las líneas de células cancerosas están disponibles, por supuesto, solamente en pacientes con cáncer y no está claro que estas terapias puedan ser aplicadas a pacientes para los cuales no se encuentra disponible una línea celular inmortal.

En la Patente de los Estados Unidos 5.976.546 de la Universidad Rockefeller se describe un método de presentación de antígenos sobre la superficie de células dendríticas combinando células dendríticas con un complejo de (a) una proteína de unión a una célula dendrítica, (b) un antígeno polipeptídico y (c) un conector. No está claro hasta qué punto afectará la presencia de una proteína de unión a una célula dendrítica y un conector a la capacidad del antígeno para generar una respuesta inmunitaria dependiente de T. Esta descripción también hace referencia a antígenos polipeptídicos solamente.

El documento WO 92/21981 describe la diagnosis y el tratamiento de enfermedades inflamatorias y degenerativas de tejidos serosos y relacionados. Este documento describe un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias y degenerativas de tejidos serosos y relacionados que comprende la etapa de administrar un complejo inmunitario que consiste en cuerpos lamelares o sus constituyentes y anticuerpos específicos para estos.

El primer propósito de la presente invención se proporcionar un método rápido y eficaz para la incorporación de moléculas a células dendríticas y con el fin de hacer que las células dendríticas y las células presentadoras de antígenos presenten las moléculas deseadas sobre su superficie. La invención hace referencia en particular a células dendríticas y células presentadoras de antígenos modificadas por medio de esta técnica. Por ejemplo, la invención pretende proporcionar un método de incorporación de antígenos a las membranas superficiales de las células dendríticas de manera que los antígenos sean presentados a las células T. Como alternativa, se pueden liberar poliácidos nucleicos que codifican antígenos en células dendríticas para su uso en técnicas de terapia génica conocidas. La adyuvancia es un fenómeno en el que un agente o combinación de agentes, utilizados junto con un antígeno, provoca en el anfitrión un incremento de la respuesta inmunológica. El Coadyuvante Completo de Freund consiste básicamente en un antígeno emulsionado en aceite con paredes de células micobacterianas. Generalmente se acepta que el coadyuvante de Freund es el inmunoestimulante más potente descubierto hasta ahora. No obstante, la producción de granulomas de tejido por el mismo en la vacunación ha dado como resultado la suspensión de su uso, no solamente en seres humanos sino también en animales experimentales. Esta resolución ignora totalmente el conocimiento patológico obvio y establecido de que la mayor parte de las respuestas inmunitarias potentes y de larga duración en los vertebrados derivan de organismos o agentes que producen un granuloma.

Un propósito adicional de la invención descrito en la presente memoria es proporcionar un coadyuvante mejorado, que tenga una eficacia que se aproxime a la del Coadyuvante de Freund pero que carezca de los efectos secundarios desagradables asociados.

En esta memoria el término "células presentadoras de antígenos" hace referencia a cualquier célula del sistema inmunitario que presente antígenos a los componentes del sistema inmunitario. Este término incluye por lo tanto las células dendríticas.

La invención se define en las reivindicaciones. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona una vesícula de fosfolípidos para producir una respuesta inmunitaria, teniendo la vesícula de fosfolípidos un antígeno o un poliácido nucleico que codifica un antígeno en ella, estando adaptada la vesícula de fosfolípidos para ser fagocitada por las células productoras de antígenos.

La vesícula de fosfolípidos es multilamelar.

La composición de fosfolípidos de la vesícula de fosfolípidos comprende: fosfatidilcolina 44-60%, esfingomielina 1525%, fosfatidiletanolamina 6-10%, fosfatidilserina 2-6%, fosfatidilinositol 2-4%, colesterol 4-12%.

Preferiblemente, la composición de fosfolípidos de la vesícula de fosfolípidos es: fosfatidilcolina 54%, esfingomielina 19%, fosfatidiletanolamina 8%, fosfatidilserina 4%, fosfatidilinositol 3%, colesterol 10%.

Opcionalmente, la composición de fosfolípidos de de la vesícula de fosfolípidos incluye lisolecitina.

Preferiblemente, la composición de fosfolípidos de la vesícula de fosfolípidos tiene 0-3% de lisolecitina.

Muy preferiblemente, la composición de fosfolípidos de la vesícula de fosfolípidos tiene 2% de lisolecitina.

La vesícula de fosfolípidos puede ser un cuerpo lamelar aislado del organismo de un mamífero.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporcionan... [Seguir leyendo]

1. Una vesícula de fosfolípidos para producir una respuesta inmunitaria, teniendo la vesícula de fosfolípidos una estructura de tipo cuerpo lamelar, multilamelar, y comprendiendo la composición de fosfolípidos de la vesícula de fosfolípidos:

fosfatidilcolina 44% a 60%, esfingomielina 15% a 25%, fosfatidiletanolamina 6% a 10%, fosfatidilserina 2% a 6%, fosfatidilinositol 2% a 4% y colesterol 4% a 12%

donde las cifras representan el porcentaje en peso, teniendo la vesícula de fosfolípidos un antígeno exógeno o un poliácido nucleico que codifica un antígeno, estando adaptada la vesícula de fosfolípidos para ser fagocitada por las células presentadoras de antígenos.

2. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en la Reivindicación 1, donde la composición de fosfolípidos comprende fosfatidilcolina 54%, esfingomielina 19%, fosfatidiletanolamina 8%, fosfatidilserina 4%, fosfatidilinositol 3%

y colesterol 10% donde las cifras representan el porcentaje en peso.

3. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, donde la composición de fosfolípido incluye lisolecitina.

4. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en la Reivindicación 3, donde la composición de fosfolípidos incluye de 0% a 3% en peso de lisolecitina.

5. Una vesícula de fosfolípido según se reivindica en la Reivindicación 3 o la Reivindicación 4, donde la composición de fosfolípidos de la vesícula incluye 2% de lisolecitina.

6. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en la Reivindicación 3 o la Reivindicación 4, donde la vesícula es un cuerpo lamelar aislado del organismo de un mamífero.

7. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, para su uso como un agente de vacunación.

8. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en la Reivindicaciones 1 a 7, que tiene una proteína que tiene una secuencia peptídica que es homóloga o idéntica a la mostrada en el ID de secuencia No 1 o No 2, y que tiene una secuencia peptídica adicional que es homóloga o idéntica a las mostradas en el ID de secuencia No 3 o No 4, donde la proteína resultante es capaz de actuar como un coadyuvante para producir una respuesta inmunitaria.

9. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en la Reivindicación 8, donde la secuencia peptídica que es homóloga muestra una homología entre 99% y 75% con el SEQ ID No 1, el SEQ ID No 2, el SEQ ID No 3 o el SEQ ID No 4, respectivamente.

10. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en la Reivindicación 8, donde la secuencia peptídica que es homóloga muestra una homología de 99% con el SEQ ID No 1, el SEQ ID No 2, el SEQ ID No 3 o el SEQ ID No 4, respectivamente.

11. Una vesícula de fosfolípidos de acuerdo con la Reivindicación 8 que tiene una proteína que tiene una secuencia peptídica como se muestra en el ID de secuencia No 1 o el ID No 2, y que tiene adicionalmente una secuencia peptídica como se muestra en el ID de secuencia No 3 o el ID No 4.

12. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, que tiene 5 dimicolato de trehalosa.

13. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7 que incorpora la secuencia 77 a 110 del péptido SP-A para presentar un antígeno a células presentadoras de antígenos profesionales y no profesionales autólogas in vitro para llevar a cabo una respuesta inmunoterapéutica en un anfitrión.

14. Una vesícula de fosfolípidos según se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7 que incorpora dimicolato de trehalosa y la secuencia 77 a 110 del péptido SP-A.

15. Células presentadoras de antígenos modificadas para inducir una respuesta inmunitaria celular que comprenden células presentadoras de antígenos aisladas de un organismo de un mamífero, modificadas por medio de la absorción de vesículas de fosfolípidos de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12.

16. Células presentadoras de antígenos modificadas según se reivindica en la Reivindicación 15, donde las células presentadoras de antígenos son células dendríticas.

17. Un método de incorporación de antígenos a células dendríticas, que comprende la etapa de mezclar vesículas de fosfolípidos de acuerdo con las Reivindicaciones 1 a 7 con células dendríticas.

18. Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunitaria que comprende una vesícula de

fosfolípidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, o células presentadoras de antígenos modificadas de acuerdo con las 1. y 16, y un portador farmacológicamente aceptable.