Método para detectar el carcinoma de pulmón mediante la detección de la presencia o la ausencia de metilación en CpG dentro del gen PTGER4 y/o elementos promotores o reguladores en un sujeto en el que la hipermetilación es indicativa de la presencia de un carcinoma de pulmón.

Métodos y ácidos nucleicos para análisis de trastornos proliferativos celulares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados morbosos respecto al estado normal. Las formas de realización particulares proporcionan métodos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits útiles para detectar o diagnosticar trastornos proliferativos celulares.

Antecedentes

Metilación de las islas CpG. Aparte de las mutaciones, la metilación aberrante de las islas CpG ha demostrado provocar un silenciamiento de la transcripción de ciertos genes que ha sido vinculado a la patogenia de diversos trastornos proliferativos celulares, incluido el cáncer. Las islas CpG son secuencias cortas ricas en dinucleótidos CpG que normalmente se suelen encontrar en la región 5' de aproximadamente el 50% de los genes humanos. La metilación de las citosinas de dichas islas provoca la pérdida de la expresión del gen y ha sido implicada en la inactivación del cromosoma X y en la impronta genómica.

Desarrollo de pruebas médicas. Dos medidas de evaluación claves de cualquier prueba de cribado o diagnóstico médico son su sensibilidad y su especificidad, las cuales miden la capacidad de la prueba para detectar con precisión a todos los individuos afectados sin excepción, y sin incluir falsamente individuos que no son portadores de la enfermedad de interés (valor predictivo) . Históricamente, muchas pruebas diagnósticas han sido criticadas por su escasa sensibilidad y especificidad.

Un resultado positivo verdadero (TP) se da cuando la prueba es positiva y la enfermedad está presente. Un resultado falso positivo (FP) se da cuando la prueba es positiva pero la enfermedad no está presente. Un resultado negativo verdadero (TN) se da cuando la prueba es negativa y la enfermedad no está presente. Un resultado falso negativo (FN) se da cuando la prueba es negativa pero la enfermedad no está presente. En este contexto: Sensibilidad = TP/ (TP+FN) ; Especificidad = TN/ (FP+TN) ; y Valor predictivo = TP/ (TP+FP) .

La sensibilidad es una medida de la capacidad de una prueba para detectar correctamente la enfermedad de interés en el individuo que es analizado. Una prueba dotada de una mala sensibilidad produce una alta tasa de falsos negativos, es decir, individuos realmente afectados por la enfermedad que la prueba no detecta como tales. El riesgo que entraña el falso negativo es que el individuo enfermo permanezca sin diagnosticar y sin tratar durante un tiempo, periodo durante el cual la enfermedad puede avanzar hasta un estadio posterior en el que los tratamientos, si existen, pueden ser menos eficaces. Un ejemplo de una prueba dotada de una baja sensibilidad es un análisis de sangre de proteínas para detectar el VIH. Este tipo de pruebas adolece de una mala sensibilidad porque es incapaz de detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad está arraigada y el virus ha invadido el torrente sanguíneo en número sustancial. En cambio, un ejemplo de prueba dotada de una alta sensibilidad es la detección de la carga viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Esa alta sensibilidad es posible porque este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequeñas del virus. La elevada sensibilidad es particularmente importante cuando las consecuencias de pasar por alto el diagnóstico son importantes.

La especificidad, por su parte, es una medida de la capacidad de una prueba para identificar con precisión a los pacientes que no están afectados por la enfermedad. Una prueba que posea una mala especificidad producirá una alta tasa de falsos positivos, es decir, individuos que son identificados como enfermos sin estarlo. Uno de los inconvenientes de los falsos positivos es que obligan a los pacientes a someterse a procedimientos o tratamientos médicos innecesarios y a afrontar los riesgos y el estrés emocional y económico que comportan, aparte de los efectos adversos que pueden tener en su salud. Una característica de las enfermedades que dificulta el desarrollo de pruebas diagnósticas dotadas de una alta especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, particularmente de los trastornos proliferativos celulares, implican a menudo una pluralidad de genes y proteínas. Además, ciertas proteínas pueden estar elevadas por razones ajenas a la enfermedad. La especificidad es importante cuando el coste o el riesgo asociados con los procedimientos diagnósticos o las intervenciones médicas ulteriores son muy altos.

El documento WO 2006/008128 muestra un método y ácidos nucleicos para la detección y el diagnóstico diferencial de cánceres de mama mediante el análisis de los patrones de metilación de genes y revela el PTGER4. No obstante, en el documento WO 2006/008128 no se da a conocer que la hipermetilación del PTGER4 usada como marcador pueda ser utilizada para la detección del cáncer de pulmón.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar el carcinoma de pulmón en un sujeto que comprende la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG en el gen PTGER4 y/o sus elementos promotores o reguladores en los cuales la hipermetilación es indicativa de la presencia de carcinoma de pulmón. La presente invención proporciona un marcador genético eficiente y único. Se prefiere un carcinoma de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

Dicha expresión se determina mediante la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en el cual la infraexpresión indica la presencia de carcinoma de pulmón.

Dicho método comprende las siguientes etapas: i) puesta en contacto del ADN genómico aislado de una muestra biológica (preferiblemente seleccionada entre un grupo constituido por: células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejidos incluidos en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitada a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) obtenida del sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos que distinguen entre los dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprende, o se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 4, donde dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótidos CpG; y ii) detección del carcinoma de pulmón.

Preferiblemente, la sensibilidad de dicha detección oscila aproximadamente entre el 75% y el 96%, o entre aproximadamente el 80% y el 90%, o entre aproximadamente el 80% y el 85%. Preferiblemente, la especificidad oscila aproximadamente entre el 75% y el 96%, o entre aproximadamente el 80% y el 90%, o entre aproximadamente el 80% y el 85%.

La detección del carcinoma de pulmón es posible mediante el análisis del estado de metilación del gen o de la secuencia genómica del PTGER4, y/o de los elementos promotores o reguladores del mismo.

La presente invención proporciona un método para averiguar parámetros epigenéticos del ADN genómico que están asociados con el desarrollo del carcinoma de pulmón. El método es útil para mejorar la detección y el diagnóstico de dicha enfermedad.

Preferiblemente, la fuente de la muestra problema debe seleccionarse entre el grupo constituido por: células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitada a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, el tipo de muestra se selecciona entre el grupo constituido por: plasma sanguíneo, esputo o materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitado a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial y raspado bronquial) y todas las combinaciones posibles de las mismas.

Específicamente, la presente invención proporciona un método de detección del carcinoma de pulmón adecuado... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar el carcinoma de pulmón mediante la detección de la presencia o la ausencia de metilación en CpG dentro del gen PTGER4 y/o elementos promotores o reguladores en un sujeto en el que la hipermetilación es indicativa de la presencia de un carcinoma de pulmón.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o una serie de reactivos que distingue entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un región diana del ADN genómico, en el que la región diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con, una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 4, en el que dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG, permitiendo así detectar dicho carcinoma de pulmón.

3. Método para detectar trastornos proliferativos celulares según la reivindicación 1 o 2, que comprende:

a) extraer o si no aislar el ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto;

b) tratar el ADN genómico de a) , o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en su posición 5´ en uracilo o en otra base que puede ser detectada como distinta de la citosina respecto a sus propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID nº 19, 20, 43, y 44, y sus complementos, en el que el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo o bien es amplificado para producir al menos un amplificado, o bien no es amplificado; y d) determinar, sobre la base de la presencia o la ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 4, o una media, o un valor que refleje un estado o nivel de metilación medio de una pluralidad de dinucleótidos CpG de la SEC ID nº 4, permitiendo así al menos uno de entre la detección y el diagnóstico de trastornos proliferativos celulares.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el tratamiento del ADN genómico, o del fragmento del mismo en b) , comprende utilizar un reactivo seleccionado del grupo que comprende bisulfito, sulfito de hidrógeno, disulfito, y combinaciones de los mismos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica obtenida del sujeto es seleccionada del grupo que comprende células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y material biológico derivado de una broncoscopia (que incluye pero no limitado a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial y combinaciones de los mismos.

6. Método para detectar trastornos proliferativos celulares según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

a) extraer o si no aislar de otra manera el ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto;

b) digerir el ADN genómico de a) , o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación;

c) poner en contacto el digerido de enzima de restricción del ADN de b) , con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 4; y d) determinar, sobre la base de la presencia o la ausencia de un amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 4, permitiendo así al menos uno de entre la detección y el diagnóstico de trastornos proliferativos celulares.

7. Utilización de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el diagnóstico, pronóstico y/o detección del carcinoma de pulmón.