Métodos para producir microfolículos pilosos y papilas de novo y su uso para ensayos in vitro e implantaciones in vivo.

Un método para producir microfolículo piloso de mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos una papila de novo,

(b) proporcionar al menos otra población celular seleccionada del grupo de fibroblastos, queratinocitos y/o melanocitos,

(c) co-cultivar la papila de novo con al menos otra población celular en condiciones de cultivo no adherente.

Métodos para producir microfolículos pilosos y papilas de novo y su uso para ensayos in vitro e implantaciones in vivo.

La presente invención se refiere a un método para producir microfolículos pilosos por co-cultivo de las papilas de novo con otra población celular del folículo piloso en los recipientes para cultivo de adhesión ultra-baja. La invención también se refiere a un método para producir papilas de novo utilizables en un método para producir microfolículo piloso. Son objeto de la invención también los microfolículos pilosos y las papilas de novo producidas por los métodos mencionados. Los microfolículos pilosos y/o las papilas de novo se pueden usar como implantes para tratar condiciones de cabello reducidas y para el ensayo in vitro de los efectos moduladores del cabello o los efectos tóxicos de sustancias.

Debido a la función crítica que desempeña el cabello en la comunicación humana no verbal, un individuo afectado demanda invariablemente ayuda cuando disminuye el crecimiento del cabello. El último tratamiento es, por supuesto, restablecer o regenerar folículos pilosos cíclicos, sanos, nuevos. Hasta muy recientemente, la medicina no podía ofrecer tratamientos válidos a estos pacientes. A finales del siglo veinte, se comercializaron diversos fármacos que, sin embargo modestamente e inconsecuentemente, estimulaban el crecimiento del cabello. Son ejemplos minoxidil, finasteride y latanoprost. La compleja sincronización y los cambios de expresión de los genes de myriad requeridos para la orquestación del desarrollo y la ciclación de folículo piloso es probable que impidan una solución farmacéutica simple al tratamiento de la alopecia avanzada. Por consiguiente, sus efectos quedan muy lejos del objetivo último de generar nuevos folículos pilosos en el cuero cabelludo calvo. Aprovechando los tipos de células que se conoce cómo forman un folículo piloso, los tratamientos con base celular llegarán a la clínica más pronto que la solución puramente molecular.

Una solución al tratamiento con base celular de folículo piloso implicaría eliminar un pequeño número de folículos pilosos, aislar células competentes y/o inductivas de los mismos y extender después esas células ex vivo al tiempo que mantener su especial capacidad para generar nuevos folículos pilosos. Claramente, las condiciones del cultivo celular que mantienen la capacidad inductiva de las células dérmicas del folículo y la competencia de las células epiteliales del folículo piloso son necesarias antes de que se pueda desarrollar cualquier tipo de tratamiento con base celular para la alopecia. Como estudios recientes demostraron que la propiedad inductiva de las células dérmicas disminuye con el tiempo in vitro, la investigación se ha centrado en mantener las propiedades tricogénicas de las células de folículo piloso en el cultivo. La mayor parte del progreso reciente ha resultado de avances en la metodología de cultivo para folículos pilosos intactos y sus componentes celulares. Las células de folículo piloso humanas desarrolladas en cultivo incluyen fibroblastos de papila folicular, queratinocitos de envoltura externa de la raíz (ORS, por sus siglas en inglés) y células epidérmicas germinativas de la matriz del cabello (Tobin et al., J. Invest. Dermatology 104 (1) , 86-88, 1.995) .

El objetivo de los esfuerzos de la bioingeniería actual es generar o reconstituir sistemas de órganos completamente organizados y funcionales partiendo de células disociadas que se han propagado en condiciones de cultivo de tejido definidas. Desde hace tiempo se ha reconocido que el folículo piloso presenta una profunda capacidad regenerativa, porque se cicla por la duración de la vida del individuo y reproduce su medio ciclo inferior después del ciclo. Los fibroblastos de las papilas pilosas dérmicas y la envoltura de tejido conjuntivo son de tipo hemocitoblasto en naturaleza y presentan propiedades de inducción del crecimiento del cabello específicas. El folículo piloso se vuelve a formar mediante interacciones entre hemocitoblastos epiteliales competentes y células dérmicas poderosamente inductivas durante su ciclo de crecimiento. Es posible reconstituir un folículo piloso completo de hemocitoblastos epiteliales y mesenquimales de folículos pilosos.

Las principales estimulaciones que se requiere estudiar con cualquier tipo de tratamiento basado en células para la alopecia incluyen la eficacia de la formación de folículo piloso y la elección del tipo de célula, que se resume por Stenn & Cotsarelis, Curr. Opinion Biotech. 16, 493-497, 2.005. Para la bioingeniería del folículo piloso, se podía empezar con elementos dérmicos de folículos disociados con o sin células competentes del folículo u otras fuentes epiteliales. El número de células disociadas se extendería en el cultivo y después las células dérmicas solas, o junto con células epiteliales competentes, se volverían a introducir en el cuero cabelludo alopécico. Los estudios previos han demostrado que partir de células dérmicas inductoras colocadas correctamente dará como resultado la formación de nuevo folículo. Por otra parte, partir de una combinación de células epiteliales y dérmicas tricogénicas, disociadas o agregadas, también ha demostrado ser una manera eficaz de producir nuevos folículos pilosos.

Los primeros intentos en las soluciones basadas en células para tratar la alopecia son probablemente usar tejido autólogo para bioingeniería de folículos pilosos para evitar el rechazo inmunológico de las células donadoras. Sin embargo, existe la interesante posibilidad de que se pueda desarrollar tejido de folículo piloso heterólogo (alogénico) para trasplante de tejido, basado en el concepto de que el folículo piloso es un sitio inmuno-privilegiado que no expresa antígenos de clase I MHC (complejo principal de histocompatibilidad, por sus siglas en inglés) . Sin embargo, el ensayo de seguridad y los obstáculos reguladores para este tipo de solución requerirían enormes recursos financieros.

Otra posible solución para los folículos pilosos de bioingeniería implica formar en realidad folículos pilosos como miniórganos in vitro y trasplantar después los folículos recién generados de nuevo en el cuero cabelludo alopécico. Se conoce a partir de la patente alemana DE 101 62 814 B4 que se puede producir un equivalente de piel y cabello proporcionando una pseudodermis o una preparación de pseudodermis, así como pseudopapilas que comprenden células de papilas dérmicas cultivadas sobre un portador adecuado o en una matriz adecuada o precursores de pseudopapilas que comprenden células de papilas dérmicas cultivadas en un medio formador de matriz adecuado, capaz de formar una matriz in situ e introducir las pseudopapilas o el precursor de las pseudopapilas en la pseudodermis o preparación de pseudodermis. Esta clase de solución requeriría un sistema de cultivo de células mucho más complicado implicando matrices tridimensionales, quizá embebidas con factores de crecimiento apropiados, para permitir que células tanto dérmicas como epidérmicas se diferencien hacia la estructura tridimensional de un folículo piloso normal. En particular, la estructura de la papila sólo se obtiene formando cavidades, tal como por punzonado o pinchazo, en dicha pseudodermis y poniendo dichas pseudopapilas en las mismas, que están conformadas para que sus dimensiones correspondan a las cavidades formadas en los PD. La solución carece de disposición voluntaria de las células en la estructura de papila fisiológica aproximada, así como contactos directos con las células.

Se ha mostrado recientemente otro método para producir una población de hemocitoblastos multipotentes o progenie de los mismos, que proceden de un folículo piloso o una porción que contiene papilas dérmicas del mismo. El método de la patente internacional WO 2005/071063 A1 comprende el cultivo de dicho folículo piloso o porción que contiene papilas dérmicas en condiciones bajo las cuales crecen hemocitoblastos multipotentes y proliferan sin adherirse. No se obtienen papilas dérmicas por este procedimiento, sino los hemocitoblastos multipotentes aislados usados directamente para inducir el crecimiento del cabello o la regeneración de piel en un mamífero. Sin embargo, también se reconoce en este documento que se forma una cierta cantidad de células adherentes como se confirma en la patente internacional WO 2005/113747 A2, que describe un método para producir agregados multicelulares a partir de al menos dos tipos de hemocitoblastos adultos multipotentes o pluripotentes por cultivo en condiciones estéricas. En el momento presente, los cuerpos organoides... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir microfolículo piloso de mamífero que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos una papila de novo,

(b) proporcionar al menos otra población celular seleccionada del grupo de fibroblastos, queratinocitos y/o melanocitos, y

(c) co-cultivar la papila de novo con al menos otra población celular en condiciones de cultivo no adherente.

2. Método según la reivindicación 1, en el que al menos otra población celular es derivable y/o deriva de un folículo piloso de mamífero, que se selecciona del grupo de fibroblastos de la envoltura de tejido conjuntivo, queratinocitos y/o melanocitos.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la papila de novo de la etapa (a) está recubierta con proteínas de matriz extracelular, preferiblemente colágeno IV, fibronectina y/o laminina.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la papila de novo se produce según uno de los métodos de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6.

5. Un método para producir papilas de novo utilizables en un método según una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos una papila dérmica (DP) de al menos un folículo piloso de mamífero,

(b) aislar fibroblastos de papila pilosa dérmica (las DPF) de la DP por fijación de manera mecánica de dicha DP en la superficie de un recipiente de cultivo celular, según lo cual la lámina basal se perfora para permitir que migren dichas DPF,

(c) extender las DPF aisladas en cultivo monocapa sin recubrimiento de colágeno, en el que dichas DPF se hacen pasar al menos una vez,

(d) condensar las DPF extendidas en agregados celulares que presentan el tamaño y la forma de la DP fisiológica, en los que dichas DPF se diferencian en recipientes de cultivo no adhesivo en una concentración de células por superficie del recipiente de 1.000 a 100.000 DPF/cm2, y

(e) recubrir las papilas de novo con proteínas de matriz extracelular, preferiblemente colágeno IV, fibronectina y/o laminina.

6. El método según la reivindicación 5, en el que las DPF extendidas se condensan durante al menos 48 h.