MÉTODOS PARA PREPARAR PROTEÍNAS QUE CONTIENEN RESTOS DE CISTEÍNA LIBRES.

Métodos para preparar proteínas que contienen restos de cisteína libres. Campo de la invención La presente invención se refiere en general a un método para preparar proteínas solubles que contienen un resto de cisteína libre que no forma un enlace disulfuro. Antecedentes de la invención Existe considerable interés por parte de pacientes y proveedores de asistencia sanitaria en el desarrollo de agentes terapéuticos proteicos accesibles, de bajo coste y de larga actuación. Las proteínas son caras de fabricar y a diferencia de las moléculas pequeñas farmacológicas convencionales, habitualmente no se absorben fácilmente por el cuerpo. Además se digieren si se toman por vía oral. Por lo tanto, las proteínas deben administrarse típicamente por inyección. Después de la inyección la mayoría de las proteínas se eliminan rápidamente del cuerpo, necesitando inyecciones frecuentes, con frecuencia diarias. A los pacientes no les gustan las inyecciones, lo que conduce a una reducción de la conformidad y reducción de la eficacia farmacológica. Algunas proteínas tales como eritropoyetina (EPO) son eficaces cuando se administran con menos frecuencia (tres veces por semana para EPO) pero esto se debe al hecho de que las proteínas están glucosiladas. La glucosilación requiere que las proteínas recombinantes se fabriquen usando sistemas de expresión de células de mamífero, que es caro y aumenta el coste de los agentes farmacéuticos proteicos. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de desarrollar tecnologías de suministro de proteínas que reduzcan los costes de agentes terapéuticos proteicos a pacientes y proveedores de asistencia sanitaria. Una solución a este problema es el desarrollo de métodos para prolongar las semividas en circulación de agentes terapéuticos proteicos en el cuerpo de modo que las proteínas no tengan que inyectarse frecuentemente. Esta solución también satisface las necesidades y deseos de los pacientes de agentes terapéuticos proteicos que sean accesibles es decir, agentes terapéuticos proteicos que no requieran inyecciones frecuentes. La modificación covalente de proteínas con polietilenglicol (PEG) ha demostrado ser un método útil para prolongar las semividas en circulación de proteínas en el cuerpo (Abuchowski et al., 1984; Hershfield, 1987; Meyers et al., 1991). La unión covalente de PEG a una proteína aumenta el tamaño eficaz de la proteína y reduce su tasa de eliminación del cuerpo. Los PEG están disponibles en el mercado en varios tamaños, lo que permite que las semividas en circulación de proteínas modificadas con PEG se adapten a indicaciones individuales a través del uso de PEG de diferentes tamaños. Otros beneficios in vivo documentados de modificación con PEG son un aumento de la solubilidad de las proteínas, estabilidad (posiblemente debido a protección de la proteína de proteasas) y una reducción de la inmunogenicidad de las proteínas (Katre et al., 1987; Katre, 1990). Un método conocido para pegilar proteínas usa compuestos tales como N-hidroxi succinimida (NHS)-PEG para unir PEG a aminas libres, típicamente en restos de lisina o en el aminoácido N-terminal. Una limitación importante de este enfoque es que las proteínas típicamente contienen varias lisinas, además del aminoácido N-terminal, y el resto de PEG se une a la proteína de forma no específica en cualquiera de las aminas libres disponibles, dando como resultado una mezcla de producto heterogénea. Muchas proteínas NHS-pegiladas son inadecuadas para uso comercial debido a bajas actividades específicas y heterogeneidad. Resulta inactivación de la modificación covalente de uno o más restos de lisina o el aminoácido N-terminal requerido para actividad biológica o de unión covalente del resto de PEG cerca del sitio activo de la proteína. Es de particular relevancia para esta solicitud el hallazgo de que la modificación de hormona de crecimiento humana (hGH) con reactivos sensibles a amina, incluyendo reactivos de NHS-PEG, reduce la actividad biológica de la proteína en más de 10 veces (Teh y Chapman. 1988; Clark et al., 1996). GH es una proteína de 22 kDa secretada por la glándula tiroides. GH estimula el metabolismo de hueso, cartílago y músculo y es la hormona principal del cuerpo para estimular crecimiento somático durante la infancia. Se usa GH humana recombinante (rhGH) para tratar la corta estatura resultante de insuficiencia de GH, síndrome de Turner e insuficiencia renal en niños. GH no está glucosilada y está completamente activa cuando se produce en bacterias. La proteína tiene una semivida in vivo corta y debe administrarse por inyección subcutánea diaria para máxima eficacia (MacGillivray et al., 1996). Existe considerable interés en el desarrollo de formas de larga actuación de hGH. Los intentos de crear formas de larga actuación de hGH por pegilación de la proteína con reactivos de PEG sensibles a amina han conseguido un éxito limitado debido a reducciones significativas de la bioactividad tras la pegilación. Además, la proteína se pegila en múltiples sitios (Clark et al., 1996). hGH contiene nueve lisinas, además del aminoácido N-terminal. Ciertas de estas lisinas se localizan en regiones de la proteína que se sabe que son críticas para la unión del receptor (Cunningham et al., 1989; Cunningham y Wells, 1989). La modificación de estos restos de lisina reduce significativamente la unión del receptor y la bioactividad de la proteína (de la Llosa et al., 1985; Martal et al., 1985; Teh y Chapman, 1988; Cunningham y Wells, 1989). hGH se modifica fácilmente por reactivos NHS-PEG, pero la actividad biológica de la proteína NHS-PEG se ve gravemente afectada, sumando solamente 1 % de la actividad 2   biológica de GH de tipo silvestre para una proteína de GH modificada con cinco moléculas de PEG de 5 kDa (Clark et al., 1996). La CE50 para esta proteína de GH pegilada de forma múltiple es 440 ng/ml o aproximadamente 20 nM (Clark et al., 1996). Además de poseer actividad biológica significativamente reducida, NHS-PEG-hGH es muy heterogénea debido a diferentes números de moléculas de PEG unidas a la proteína y en diferentes restos aminoacídicos, lo que tiene un impacto en su utilidad como un agente terapéutico potencial. Clark et al. (1996) mostraron que la semivida en circulación de NHS-PEG-hGH en animales se prolonga significativamente en relación con GH no modificada. A pesar de poseer una actividad biológica in vitro significativamente reducida, NHS-PEGhGH fue eficaz y pudo administrarse con menos frecuencia que hGH no modificada en un modelo de rata deficiente en GH (Clark et al., 1996). Sin embargo, se requirieron altas dosis de NHS-PEG-hGH (60-180 µg por inyección por rata) para eficacia en los modelos animales debido a la baja actividad específica de la proteína modificada. Existe una clara necesidad de mejores métodos para crear proteínas de hGH pegiladas que conserven mayor bioactividad. También existe una necesidad de desarrollar métodos para pegilar hGH de modo que se cree un producto de PEGhGH homogéneo. Las actividades biológicas de varias otras proteínas comercialmente importantes se redujeron significativamente por reactivos de PEG sensibles a amina. EPO contiene varios restos de lisina que son críticos para la bioactividad de la proteína (Boissel et al., 1993; Matthews et al., 1996) y la modificación de los restos de lisina en EPO da como resultado pérdida casi completa de actividad biológica (Wojchowski y Caslake, 1989). La modificación covalente de interferón alfa 2 con PEG sensibles a amina da como resultado 40-75 % de pérdida de bioactividad (Goodson y Katre, 1990; Karasiewicz et al., 1995). La pérdida de actividad biológica es mayor con PEG grandes (por ejemplo, 10 kDa) (Karasiewicz et al., 1995). La modificación covalente de G-CSF con PEG sensibles a amina da como resultado más del 60 % de pérdida de bioactividad (Tanaka et al., 1991). La modificación extensiva de IL-2 con PEG sensibles a amina da como resultado más del 90 % de pérdida de bioactividad (Goodson y Katre, 1990). Un segundo método conocido para pegilar proteínas une covalentemente PEG a restos de cisteína usando PEG sensibles a cisteína. Están disponibles en el mercado varios PEG sensibles a cisteína altamente específicos con diferentes grupos reactivos (por ejemplo, maleimida, vinilsulfona) y PEG de diferentes tamaños (2-40 kDa). A pH neutro, estos reactivos de PEG se unen de forma selectiva a restos de cisteína libres, es decir restos de cisteína no implicados en enlaces disulfuro. Los restos de cisteína en la mayoría de las proteínas participan en enlaces disulfuro y no están disponibles para pegilación usando PEG sensibles a cisteína. A través de mutagénesis in vitro usando técnicas de ADN recombinante, pueden introducirse restos de cisteína adicionales en cualquier lugar... [Seguir leyendo]

1. Un método para obtener una proteína soluble que tenga al menos una cisteína libre añadida que comprende la etapa de: a) obtener una célula hospedadora capaz de expresar la proteína soluble, en la que la proteína soluble contiene al menos una cisteína libre añadida; b) exponer la célula hospedadora a un agente de bloqueo de cisteína antes de la etapa (c), en la que dicho agente de bloqueo de cisteína forma un disulfuro estable, reversible, mezclado con al menos un resto de cisteína en dicha proteína soluble; y c) aislar la proteína soluble de la célula hospedadora, en la que la proteína soluble contiene al menos una cisteína libre, siendo el agente de bloqueo de cisteína un compuesto sensible a tiol seleccionado del grupo que consiste en cistina o un derivado de la misma, cistamina o un derivado de la misma, ácido ditioglicólico o un derivado de la misma y glutatión oxidado o un derivado del mismo. 2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha etapa (b) de exposición comprende romper la célula hospedadora en presencia del agente de bloqueo de cisteína y en el que dicha etapa (c) de aislamiento comprende aislar la proteína de la fracción soluble de la célula hospedadora rota. 3. El método de la reivindicación 1, en el que la exposición de la célula hospedadora a un agente de bloqueo de cisteína se produce antes, durante o después de la síntesis de la proteína soluble por la célula hospedadora y en el que la proteína soluble se secreta de la célula hospedadora. 4. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) de exposición comprende exponer medios que contienen la proteína soluble a un agente de bloqueo de cisteína antes de la etapa (c). 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha célula hospedadora es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o de mamífero. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha célula hospedadora es una célula bacteriana. 7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha célula hospedadora es E. coli. 8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende adicionalmente unir un resto sensible a cisteína a dicha proteína aislada para formar una proteína modificada por cisteína. 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente unir un polietilenglicol a dicha proteína aislada para formar una proteína pegilada. 10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha proteína soluble es una proteína recombinante. 11. El método de la reivindicación 10, en el que una de dos cisteínas implicadas en un enlace disulfuro nativo en dicha proteína soluble se ha suprimido o sustituido con otro aminoácido, dejando la segunda de dichas dos cisteínas como dicha cisteína libre añadida. 12. El método de la reivindicación 10, en el que dicha proteína recombinante es una muteína de cisteína de un miembro de la familia del supergen de la hormona del crecimiento, un derivado o un antagonista de la misma. 13. El método de la reivindicación 12, en el que dicho miembro es hormona del crecimiento. 14. El método de la reivindicación 12, en el que dicho miembro es eritropoyetina. 15. El método de la reivindicación 12, en el que dicho miembro es interferón alfa (IFN-). 16. El método de la reivindicación 12, en el que dicho miembro es interferón alfa 2 (IFN-2). 17. El método de la reivindicación 10, en el que dicha proteína recombinante es una muteína de cisteína de un miembro de la superfamilia de TGFbeta, factor de crecimiento derivado de plaquetas A, factor de crecimiento derivado de plaquetas B, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado de cerebro, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crecimiento endotelial vascular o un derivado o un antagonista del mismo, leptina, insulina, factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF1), superóxido dismutasa, catalasa, asparaginasa, uricasa, factor de crecimiento de fibroblastos, arginasa, angiostatina, endostatina, Factor VIII, Factor IX, antagonista del receptor de 51   interleucina 1, proteasa nexina y antitrombina III. 18. El método de la reivindicación 10, en el que dicha proteína recombinante es una muteína de cisteína de una cadena pesada o ligera de una inmunoglobulina o un derivado de la misma. 19. Una hormona del crecimiento humana (hGH) pegilada o un derivado de la misma que tenga una CE50 de menos de aproximadamente 400 ng/ml y que se obtiene por el método de la reivindicación 9, en la que el resto de PEG está unido a un bucle C-D o una región proximal a la hélice A de dicha hGH. 20. Una eritropoyetina pegilada (EPO) o un derivado de la misma que tenga una CE50 de menos de aproximadamente 1000 ng/ml y que se obtiene por el método de la reivindicación 9, en la que el resto de PEG está unido a la región que precede a la hélice A, la región distal a la hélice D, un bucle C-D, un bucle B-C o un bucle A-B de EPO. 21. Un interferón alfa pegilado (IFN-2) o un derivado que tiene una CE50 de menos de aproximadamente 1900 pg/ml y que se obtiene por el método de la reivindicación 9, en el que el resto de PEG está unido a una región proximal a la hélice A, la región distal a la hélice E o un bucle C-D de IFN-2. 22. Uso de una variante de cisteína de la hormona del crecimiento o un derivado de la misma obtenido por el método de la reivindicación 13 o de acuerdo con la reivindicación 19 para la preparación de un medicamento para tratar una afección tratable con hormona del crecimiento seleccionada del grupo que consiste en deficiencia de hormona del crecimiento, corta estatura resultante de la inadecuación de la hormona del crecimiento, Síndrome de Turner e insuficiencia renal en niños y caquexia. 23. Uso de una variante de cisteína de EPO o un derivado de la misma obtenido por el método de la reivindicación 14 o de acuerdo con la reivindicación 20 para la preparación de un medicamento para estimular un aumento del hematocrito o anemia inducida por quimioterapia. 24. Uso de una variante de cisteína de interferón alfa o un derivado de la misma obtenido por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 o de acuerdo con la reivindicación 21 para la preparación de un medicamento para tratar una afección tratable con interferón alfa seleccionada del grupo que consiste en una enfermedad viral, una enfermedad de proliferación celular y crecimiento de células tumorales. 25. Uso de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho derivado es una variante de cisteína pegilada de la hormona de crecimiento, EPO o interferón alfa. 26. Un método para modificar de forma covalente una proteína producida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 10 a 18, que comprende las etapas de: a) purificar la proteína soluble; b) reducir la proteína con un agente reductor de disulfuro; y c) exponer la proteína a un resto sensible a cisteína para obtener una proteína modificada por cisteína. 27. El método de la reivindicación 26, que comprende adicionalmente aislar la proteína modificada por cisteína de la proteína no modificada. 28. El método de la reivindicación 26, en el que el resto sensible a cisteína es un polietilenglicol. 52   53