Un método de vitrificación de un espécimen biológico que comprende:

(a) la colocación del espécimen biológico en un instrumento de transferencia; y

(b) la colocación del instrumento de transferencia y del espécimen biológico directamente en un material congelante, en el que el instrumento de transferencia no es una rejilla de microscopía electrónica ni una pajuela, y en el que además el espécimen biológico es expuesto directamente al material congelante experimentando de este modo la vitrificación, y en el que además el espécimen biológico será viable después de que el espécimen biológico sea descongelado.

Método para la vitrificación de un espécimen biológico

Apoyo del Gobierno

Declaración Referente a los Derechos a las Invenciones Realizadas Bajo Investigación y Desarrollo Patrocinados Federalmente.

Parte del trabajo realizado durante el desarrollo de esta invención ha utilizado Fondos del Gobierno de EE.UU., específicamente del National Institute of Child Health and Human Development, Subvención Nº HD22023. Por tanto, el Gobierno de EE.UU. tiene ciertos derechos en esta invención.

Campo técnico

Esta invención se refiere a un método para la vitrificación de un espécimen biológico, de tal manera que el espécimen biológico permanece viable después de ser descongelado.

Antecedentes de la invención

La capacidad para crioconservar oocitos, embriones, esperma y otros especímenes biológicos similares es crítica para la aplicación generalizada de tecnologías de reproducción asistida. Sin embargo, debido al gran volumen de las células y a la elevada sensibilidad al enfriamiento de los oocitos y de los embriones tempranos, las técnicas de crioconservación no están bien desarrolladas en la mayoría de las especies.

Tradicionalmente, los embriones son crioconservados utilizando "técnicas de congelación lenta". Las bajas concentraciones de crioprotectores y las lentas velocidades controladas de enfriamiento, normalmente en el rango de 0, 1-0, 3 C/minuto, deshidratan lentamente la célula durante la congelación para impedir la cristalización intracelular. Debido a esto, la crioconservación de oocitos, embriones y otras células susceptibles de desarrollo utilizando tales procedimientos tiene como resultado una capacidad reducida para establecer y mantener el embarazo después de la transferencia. Los oocitos son particularmente susceptibles al daño por crioconservación debido a la alteración de la integridad de los microtúbulos del huso de la metafase durante el enfriamiento.

Los métodos de crioconservación anteriores alternativos se han basado en la vitrificación con altas concentraciones de crioprotectores, los cuales cuando se enfrían rápidamente tienen como resultado un estado similar al vidrio. Sin embargo, una desventaja de esta técnica de vitrificación es que los crioprotectores son muy tóxicos para los oocitos, embriones y otras células susceptibles de desarrollo delicadas. La toxicidad de los crioprotectores puede ser minimizada incrementando la velocidad de enfriamiento, lo cual se ha conseguido sumergiendo los oocitos mantenidos sobre rejillas para microscopía electrónica, o dentro de pajuelas de paredes finas (conocidas como pajuelas estiradas abiertas) , directamente en nitrógeno líquido. Sin embargo, estos procedimientos son ambos tediosos y la recuperación de los embriones es problemática.

Riha y col., Resumen de Biosis, 1991:496738 y en Zivocisma Vyroba (1991) , 36, 113-119, describen un método de vitrificación en el que embriones bovinos de siete días de edad se dejaron caer gota a gota en nitrógeno líquido por medio de un capilar de manipulación desde una altura de 5 a 7 cm, donde se conservaron en forma de gotas. Por tanto, permanece la necesidad de un método para la vitrificación de un espécimen biológico que sea capaz de maximizar la velocidad de enfriamiento de las células del espécimen; de mantener la viabilidad del espécimen durante la vitrificación y la descongelación posterior; de impedir el estrés mecánico al espécimen y de proporcionar una facilidad de manipulación durante la crioconservación y la recuperación.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un método de vitrificación de un espécimen biológico. De acuerdo con el método de la presente invención, un espécimen biológico es expuesto directamente a un material congelante. Después de la exposición al material congelante, el espécimen biológico experimenta vitrificación. El espécimen biológico que ha sido sometido a vitrificación puede ser almacenado durante un periodo de tiempo y posteriormente descongelado en una fecha posterior. El espécimen biológico descongelado permanece viable. Los especímenes biológicos de acuerdo con la presente invención son seleccionados del grupo consistente en oocitos, blastocitos, embriones y mórulas.

La presente invención está dirigida también a un método de vitrificación de un espécimen biológico, que incluye la utilización de un instrumento de transferencia para colocar el espécimen biológico en un material congelante, tal como nitrógeno líquido, de tal manera que el espécimen biológico es expuesto directamente al material congelante. El espécimen biológico experimenta luego vitrificación mientras está sostenido por el instrumento de transferencia, siendo un instrumento de transferencia un asa abierta. El instrumento de transferencia y el espécimen biológico son luego mantenidos preferiblemente dentro del material congelante y transferidos a un recipiente que contiene un material congelante. El recipiente es preferiblemente un vial. El vial es luego cerrado herméticamente y contiene el material congelante, el asa y el espécimen biológico vitrificado, y puede ser crioconservado hasta el momento en el que se requiera el espécimen biológico para un uso posterior.

Una realización de la presente invención es el tratamiento del espécimen biológico en un crioprotector antes de la vitrificación.

La invención se refiere también a un método para descongelar un espécimen biológico que haya sido sometido a vitrificación. El método de descongelación comprende la extracción del espécimen biológico del material congelante en el que ha sido crioconservado, y la colocación del espécimen biológico en una solución de descongelación templada. La solución de descongelación puede estar presente en cualquier recipiente adecuado, y está situada preferiblemente en una placa de cultivo o en una pajuela.

Un realización más de la presente invención es un método de vitrificación de células susceptibles de desarrollo, en el que una o más células susceptibles de desarrollo son colocadas directamente en un material congelante, de tal manera que cada célula susceptible de desarrollo es expuesta directamente al material congelante, experimentando de este modo vitrificación, en el que las células susceptibles de desarrollo vitrificadas, cuando son descongeladas, cultivadas e implantadas en organismos huésped adecuados, tendrán como resultado una tasa de fertilidad igual a la de las mismas células susceptibles de desarrollo que no han sido vitrificadas. Preferiblemente, las células susceptibles de desarrollo están contenidas en un asa cuando son expuestas al material congelante.

La presente invención se refiere también a un método de vitrificación de un blastocisto de mamífero o de un embrión de mamífero en estadio de división, que comprende la colocación de uno o más blastocistos o embriones en estadio de división directamente en un material congelante, de tal manera que cada blastocisto o embrión en estadio de división es expuesto directamente al material congelante experimentando de este modo vitrificación, en el que al menos un 80 por ciento, y más preferiblemente un 90 por ciento, de los blastocistos o embriones en estadio de división vitrificados serán viables después de ser descongelados y cultivados, preferiblemente en el medio base apropiado. Preferiblemente, el blastocisto o el embrión en estadio de división está contenido en un asa cuando es expuesto al material congelante. La presente invención se refiere también a un método de vitrificación de un embrión de caballo o de un embrión de cerdo, que comprende la colocación de uno o más embriones directamente en un material congelante, de tal manera que cada embrión es expuesto directamente al material congelante, experimentando de este modo vitrificación, en el que al menos un 25 por ciento, y más preferiblemente un 50 por ciento, de los embriones vitrificados serán viables después de ser descongelados y cultivados, preferiblemente en el medio base apropiado. Preferiblemente, el embrión está contenido en un asa cuando es expuesto al material congelante.

La presente invención se refiere también a un kit para la vitrificación de un espécimen biológico. El kit contendrá generalmente instrucciones que describan la vitrificación de un espécimen biológico, en la que el espécimen es expuesto directamente a un material congelante. El kit incluirá también uno o más ingredientes opcionales incluyendo, pero sin limitarse a, un instrumento de transferencia, muy preferiblemente...

1. Un método de vitrificación de un espécimen biológico seleccionado del grupo que comprende oocitos, embriones, blastocitos y mórulas que comprende:

(a) la colocación del espécimen biológico en un una asa abierta o mediante

(i) la colocación del espécimen biológico en un medio básico y la utilización del asa para tomar el espécimen biológico del medio básico; o

(ii) sumergir el asa en un medio básico para formar una película del medio básico en el asa y depositar el espécimen biológico mediante a través de una pipeta directamente en el asa; donde el medio básico comprende un crioprotector; y

(b) la colocación del asa directamente en un material congelante, donde el espécimen biológico es expuesto directamente al material congelante, experimentando de este modo la vitrificación y en el que además el espécimen biológico será viable una vez descongelado el espécimen biológico descongelado.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además:

(c) la descongelación del espécimen biológico que ha experimentado la vitrificación.

3. El método de la reivindicación 1, en el que (b) comprende además:

(i) la transferencia del espécimen biológico que ha experimentado la vitrificación a un recipiente de almacenamiento, conteniendo el recipiente de almacenamiento un material congelante; y

(ii) el almacenamiento del recipiente de almacenamiento que contiene el espécimen biológico que ha experimentado la vitrificación hasta que el espécimen biológico esté listo para ser descongelado.

4. El método de la reivindicación 2, en el que (c) comprende además:

(i) la extracción del espécimen biológico del material congelante; y

(ii) la colocación del espécimen biológico en una solución de descongelación.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la solución de descongelación está contenida en una placa de cultivo.

6. El método de la reivindicación 4, en el que la solución de descongelación está contenida en una pajuela.

7. El método de la reivindicación 1, en el que (a) comprende además: la colocación del espécimen biológico en un medio y donde además (b) comprende además:

(i) la colocación del asa que contiene el espécimen biológico en el material congelante, en el que el material congelante está colocado en un recipiente, de tal manera que el espécimen biológico experimente vitrificación; y

(ii) el cierre hermético del recipiente que contiene el material congelante, del asa y el espécimen biológico.

(c) la descongelación del espécimen biológico que ha experimentado vitrificación.

9. El método de la reivindicación 8, en el que (c) comprende además:

(i) la extracción del espécimen biológico del material congelante; y

(ii) la colocación del espécimen biológico en una solución de descongelación.

8. El método de la reivindicación 7, que comprende además:

10. El método de la reivindicación 9, en el que la solución de descongelación está contenida en una placa de cultivo.

11. El método de la reivindicación 9, en el que la solución de descongelación está contenida en una pajuela.