Un método para la determinación cuantitativa de un poloxámero en una muestra líquida de proteínas que comprende las etapas de someter dicha muestra a:

a) una etapa de separación utilizando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular;

b) una etapa de elución con una fase móvil; y

c) opcionalmente una etapa de detección para el poloxámero,

en el que la proteína tiene una masa molecular entre 5-70 kDa, preferiblemente entre 20-70 kDa y en donde el pH de la fase móvil utilizada para la etapa de elución se ajusta por debajo de 3.

Método para la determinación de poloxámeros Campo de la invención La invención se refiere al campo de la determinación analítica de un tensioactivo que pertenece a la clase de poloxámeros en una muestra líquida de proteínas.

Antecedentes de la invención

Los poloxámeros son copolímeros de bloques no iónicos de óxido de etileno (EO1) y óxido de propileno (PO) . Se utilizan en formulaciones farmacéuticas como tensioactivos, agentes emulsionantes, agentes de solubilización y agentes dispersantes.

Un método analítico muy conocido para caracterizar un poloxámero es un método calorimétrico en el que se analiza la absorbancia de UV a 320 y 620 nm, que resulta de la formación de complejos del poloxámero con tiocianato de cobalto (ll) .

Yun Mao et al., (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35 (2004) , 1127) describe para la determinación de poloxámero el uso de cromatografía de exclusión por tamaño molecular (SEC) que utiliza una columna con THF como fase móvil y la detección del índice de refracción (RI) . El método se aplicó a las formulaciones farmacéuticas Avapro, Neurontin y Sudafed en las que el principio activo es una "molécula pequeña". Las moléculas pequeñas se pueden separar convenientemente por SEC de los poloxámeros de alta masa molecular.

La cromatografía de exclusión por tamaño molecular (SEC) , también llamada cromatografía de permeabilidad en gel (GPC) , usa partículas porosas para separar moléculas de diferentes tamaños. Se utiliza generalmente para separar moléculas polímeras y para determinar los pesos moleculares y las distribuciones de pesos moleculares de polímeros. Las moléculas que son más pequeñas que el tamaño de los poros pueden entrar en las partículas y por consiguiente tienen una trayectoria más larga y un tiempo de tránsito mayor que las moléculas mayores que no pueden entrar en las partículas. Todas las moléculas mayores que el tamaño de los poros son retenidas y se eluyen juntas. Las moléculas que pueden entrar por los poros tendrán un tiempo de permanencia medio en las partículas que depende del tamaño y forma de las moléculas. Por consiguiente diferentes moléculas tienen diferentes tiempos de tránsito totales a través de la columna.

Hasta ahora no se ha propuesto ningún método que permita la determinación cuantitativa de poloxámeros en muestras de proteínas, en las que la proteína tiene una masa molecular comparable a la de los poloxámeros.

En particular es necesaria la determinación cuantitativa de poloxámeros en muestras de proteínas, en las que la proteína tiene una masa molecular entre 5 y 70 kDa, preferiblemente entre 20 y 70 kDa.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método que permite la determinación cuantitativa de un poloxámero en una muestra de proteínas, en particular una muestra líquida de proteínas, por ejemplo en una formulación farmacéutica líquida. En particular, la invención proporciona un método para la medida cuantitativa de la concentración de poloxámeros en una muestra de proteínas. Así, en cualquier momento durante el periodo de validez de aproximadamente 2 años de una formulación proteínica, se puede determinar la cantidad de poloxámero en dicha formulación.

La presente invención se refiere a un método para la determinación cuantitativa de un poloxámero en una muestra líquida de proteínas que comprende las etapas de someter dicha muestra a:

(a) una etapa de separación utilizando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular;

(b) una etapa de elución con una fase móvil; y

(c) opcionalmente una etapa de detección para el poloxámero,

en el que la proteína tiene una masa molecular entre 5-70 kDa, preferiblemente entre 20-70 kDa y en donde el pH de la fase móvil utilizada para la etapa de elución se ajusta a un valor por debajo de 3.

Así la cromatografía de exclusión por tamaños moleculares combinada con una etapa de elución con una fase móvil como se ha definido anteriormente, permite separar el poloxámero de los restantes ingredientes.

El poloxámero se detecta en una etapa adicional analizando la fase eluida, por ejemplo utilizando un sistema de detección del IR (índice de refracción) .

Todas la abreviaturas usadas en este texto son las correspondientes a las expresiones inglesas, por su carácter internacional.

Breve descripción de la Figuera de los dibujos

La Figura 1 muestra un cromatograma para la determinación cuantitativa de Poloxámero 188 en una formulación de hCG (gonadotropina coriónica humana) . El área del pico del Poloxámero 188 se encuentra en este ejemplo a un tiempo de elución de aproximadamente 14-16 minutos (el tiempo de retención puede variar en función del caudal) . El área bajo la curva presenta la cuantificación del Poloxámero 188 en la muestra de hCG.

Abreviaturas

En la descripción de la invención se usan las siguientes abreviaturas:

FSH: hormona estimulante del folículo; r-FSH; r-LH; r-hCG; r-GH; r-IFN beta, r-TSH: FSH, LH, hCG, GH, IFN beta, TSH recombinantes; hFSH: FSH humana; r-hFSH: FSH humana recombinante IR: Índice de refracción KD o Kd o kDa. kilo Dalton SEC: Cromatografía de exclusión por tamaños moleculares RT: Temperatura ambiente WFI: agua para inyección Poloxámero 188: sinónimo de Pluronic F68 de BASF Inc.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método conveniente que permite la determinación cuantitativa de un poloxámero - que es un tensioactivo - en una muestra de proteínas. La muestra de proteínas es una muestra líquida de proteínas. La muestra líquida de proteínas puede estar en forma de una formulación líquida, preferiblemente es una formulación farmacéutica líquida como se describe a continuación. En una realización, dicha muestra de proteínas farmacéutica líquida está contenida en un vial, bien para administración unidosis o multidosis.

En una realización adicional, la muestra de proteínas que va a ser analizada se liofiliza y se solubiliza en un disolvente acuoso adecuado antes de ser analizada.

La presente invención proporciona un método para la determinación cuantitativa de un poloxámero en una muestra líquida de proteínas que comprende las etapas de someter dicha muestra a:

(a) una etapa de separación utilizando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular;

(b) una etapa de elución con una fase móvil; y

(c) opcionalmente una etapa de detección para el poloxámero,

en donde la proteína tiene una masa molecular entre 5-70 kDa, preferiblemente entre 20-70 kDa y en donde el pH de la fase móvil utilizada para la etapa de elución se ajusta a un valor por debajo de 3.

Típicamente la columna de exclusión por tamaño molecular sería una columna SE-HPLC.

En una realización, el poloxámero es Poloxámero 188.

La relación entre la masa de las proteínas y la masa del poloxámero respectivo puede estar preferiblemente entre 1:3 y 10:1, preferiblemente entre 1:2 y 7:1.

Ejemplos de proteínas de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas de mamíferos, tales como, por ejemplo, hormona del crecimiento (somatotropina) , incluyendo la somatotropina humana y la somatotropina bovina; factor de liberación de la hormona del crecimiento (somatoliberina) ; hormona paratiroidea (paratirina) ; hormona estimuladora del tiroides (tirotropina) ; lipoproteínas; a-1-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona estimulante de los folículos (folitropina) ; coriogonadotropina; calcitonina; hormona luteinizante (lutropina) ; glucagón; factores de coagulación, tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular (tromboplastina hística) y factor de von Willebrand; factores anti-coagulantes, tales como la proteína C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa o activador de plasminógeno tisular (t-PA) ; bombazina; trombina; factor alfa y factor beta de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (factor expresado y secretado por los linfocitos T normales en función de su grado de activación) ; proteína inflamatoria de macrófagos humana (MIP-I-alfa) ; seroalbúmina, tal como seroalbúmina humana; sustancia inhibidora de Müller; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; pro-relaxina; péptido asociado a la gonadotropina... [Seguir leyendo]

1. Un método para la determinación cuantitativa de un poloxámero en una muestra líquida de proteínas que comprende las etapas de someter dicha muestra a: a) una etapa de separación utilizando una columna de cromatografía de exclusión por tamaño molecular; b) una etapa de elución con una fase móvil; y

c) opcionalmente una etapa de detección para el poloxámero, en el que la proteína tiene una masa molecular entre 5-70 kDa, preferiblemente entr.

2. 70 kDa y en donde el pH de la fase móvil utilizada para la etapa de elución se ajusta por debajo de 3.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el poloxámero es Polóxamero 188.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proteína es una proteína heterodímera.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la proteína es una gonadotropina seleccionada de FSH, LH, hCG y TSH.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la proteína que se va a analizar es interferón beta o la hormona del crecimiento (GH) .

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra es una composición farmacéutica acuosa que contiene FSH, LH, hCG, TSH, GH o interferón beta.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fase móvil es un disolvente acuoso en particular un disolvente tamponado.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH de la fase móvil se ajusta a aproximadamente 1, 9-2, 0

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa de detección del poloxámero implica analizar el índice de refracción.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la columna de exclusión por tamaño molecular es una columna de SE-HPLC rellena de un polímero basado en una matriz que contiene perlas.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que las perlas de la matriz tienen un tamaño de partículas de 10 o 17 μm.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en el que las perlas de la matriz tienen un tamaño deporos de aproximadamente 200 Ã.