Método para el procesamiento del tejido óseo alogénico,y recipiente para llevarlo a cabo,

que comprende los siguientes cuatro procedimientos de aplicación sucesiva:

- Lavado individualizado de cada aloinjerto óseo en recipiente hermético y sumergido en suero fisiológico a 60°c durante 10 minutos y seguido 1 minuto de agitación manual enérgica.

- Centrifugación individualizada de cada aloinjerto, a 2.000 revoluciones por minuto durante 15 minutos para 1500 g. en recipiente especifico de PVC.

- Pasteurización individualizada de cada aloinjerto durante 90 minutos en recipiente estéril hermético con suero fisiológico precalentado a 60°C.

- Control microbiológico final, pesando el suero de la pasteurización a través de filtro de papel con tamaño de poro de 0,45 {mi}m, y cultivando dicho filtro en medio de cultivo para microorganismos aerobios, anaerobios y hongos.

Método para el procesamiento del tejido óseo alogénico y recipiente para llevarlo a cabo.

OBJETO DE LA INVENCION

La invención, tal como expresa el enunciado de la presente memoria descriptiva, se refiere a un método para el procesamiento del tejido óseo alogénico y a un recipiente para llevarlo a cabo.

Más en particular, el objeto de la invención se centra en el desarrollo de una nueva metodología de procesamiento para aloinjertos óseos, que reúne las características de sencillez, eficacia, efectividad y eficiencia, permitiendo obtener aloinjertos de mayor calidad biológica que los obtenidos con otros métodos de procesamiento, suponiendo, por tanto, una mejorada alternativa a lo ya conocido en este campo. Además, la invención comprende un segundo aspecto relativo a un recipiente específico adaptado para llevar a cabo una de las etapas del procedimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Como es sabido, llamamos Injerto Osteotendinoso a cualquier material biológico compuesto por tejido óseo, tendinoso o combinación de ambos, extraído de su emplazamiento original para ser utilizado en un lugar distinto de este.

Los aloinjertos osteotendinosos son portadores de elementos celulares y humorales susceptibles de producir una reacción inmunitaria huésped contra injerto en el receptor.

El contenido celular del injerto (células del tejido óseo, células del estroma tisular, precursores hematopoyéticos, vasos y nervios) sufre fenómenos de necrosis isquémica desde el momento de su extracción (autoinjertos) o desde el momento del fallecimiento del donante (aloinjertos) ; la duración de la isquemia y su carácter de fría o caliente determina cambios irreversibles en el interior del injerto en una doble vertiente: por una parte se produce deterioro de la matriz orgánica e inactivación de factores humorales osteoinductores (BMPs, citoquinas de la familia de los TGF tipo , relacionados con el contenido colágeno de la matriz) , por otra parte los fenómenos de necrosis favorecen la contaminación de los injertos.

Ambos fenómenos deben ser evitados para garantizar la calidad de los injertos. Se pueden producir, además, reacciones de hidrólisis y oxidación como la peroxidación lipídica.

Todos estos fenómenos altamente nocivos para la calidad e incluso la supervivencia del injerto necesitan de la presencia de “agua libre” (15, 33) en el interior del tejido. De hecho, la inmovilización del agua libre es uno de los principales objetivos que debe cumplir la preservación de los aloinjertos osteotendinosos, la cual puede conseguirse a través de varias vías:

- Ultracongelación: Por debajo de –80º no existe agua libre en el estroma tisular (las moléculas de H2O están inmovilizadas en forma de cristales de hielo) , además del efecto de destrucción celular que produce la congelación rápida. La ultracongelación (20, 26, 28, 29, 34, 41) es, por tanto, un excelente medio de preservación de injertos osteotendinosos.

- Liofilización (17) : Aplicación de un procedimiento de congelación-deshidratación (sublimación del contenido en agua desde partículas de hielo sólido a vapor de agua) . La deshidratación desde la fase de hielo sólido previene también la desnaturalización proteica que puede producirse durante el proceso de congelación aislado.

- El tercer método para inmovilizar el agua libre es la inmersión en fluidos con muy elevada concentración de solutos. La salazón de determinados alimentos como método de conservación por periodos prolongados conseguía precisamente la inmovilización del agua libre, impidiendo o retardando los fenómenos de putrefacción. En el caso de los tejidos para uso en la clínica se emplea en ocasiones el glicerol a determinada concentración, en especial para la piel y para la obtención de matriz ósea desmineralizada (27, 33) .

La incorporación de los aloinjertos osteotendinosos se consigue a través de mecanismos de osteoconducción y osteoinducción. Los aloinjertos no son osteoformadores directos de tejido óseo. Por tanto, todo aquello que mejore aquellos dos mecanismos será beneficioso para el resultado final.

El tejido óseo alogénico está compuesto por la matriz ósea, las células propias del tejido óseo (osteoblastos/osteocitos y osteoclastos) , tejido hematopoyético, médula ósea grasa, vasos y nervios, todos ellos incluidos en la red tridimensional de sales cálcicas que constituye el soporte físico del tejido óseo.

Atendiendo a las propiedades biológicas óptimas de un aloinjerto osteotendinoso, es vital la

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preservación de la matriz ósea, tanto su fracción orgánica como inorgánica. El resto de componentes del tejido carece de propiedades beneficiosas y podría, o debería, ser eliminado.

Desde el punto de vista de los fenómenos de osteoinducción, lo más importante es la preservación de la matriz ósea, compuesta por fibras colágenas y otras proteínas (proteínas de adhesión celular, osteocalcina, BMPs, etc.) .

Gracias al conjunto de las dos fases de la matriz ósea, orgánica e inorgánica, el tejido óseo posee sus propiedades mecánicas características, combinando dos propiedades aparentemente contradictorias como son rigidez y elasticidad.

Las fibras colágenas flexibilidad y resistencia a la flexión, torsión y tensión. La matriz mineralizada le confiere resistencia a la compresión y la dureza necesaria para servir de soporte al conjunto del organismo.

Desde el punto de vista de los fenómenos de osteoconducción, lo importante es mantener intacta la matriz ósea mineralizada, esto es, la estructura física del tejido óseo.

Existe evidencia de que la eliminación de ciertos componentes de la matriz orgánica de los aloinjertos mejora sus propiedades biológicas:

- La eliminación del contenido en lípidos, material abundante especialmente en áreas metáfisodiafisarias, mejora la incorporación de los aloinjertos. Estudios en animal de experimentación comparando el comportamiento biológico de aloinjertos con y sin eliminación de los lípidos, demostraron que los sometidos a eliminación del contenido en lípidos (4, 17, 26, 39, 40, 44) mediante cloroformo-metanol mostraron:

- Mejor incorporación.

- Histomorfometría: Mayor formación y reabsorción ósea.

- Gammagrafía a las 3 semanas del implante: captación del isótopo por parte del injerto (mayor tasa de remodelación ósea) .

- Conservación de las propiedades mecánicas.

- La presencia de grasa en el interior de los aloinjertos puede dificultar determinadas aplicaciones clínicas: la impactación de fragmentos de tejido esponjoso para relleno de cavidades, durante la cirugía de recambio protésico de cadera, se facilita si los fragmentos han sido lavados para eliminar el contenido graso. En caso contrario, al ser la grasa un líquido incompresible, los esfuerzos mecánicos para la impactación serán menos eficaces (7) y persistirá cierta tendencia al deslizamiento por el efecto lubricante de la propia grasa.

- La eliminación del contenido en proteínas libres disminuye el riesgo de transmisión de

enfermedades vehiculadas por priones (5, 8, 10, 11, 13, 18, 19, 25, 31, 38, 42, 43)

.

- La reducción del contenido celular disminuye la capacidad inmunogénica de los aloinjertos y reduce la posibilidad de transmisión de patógenos intracelulares: el tejido óseo no procesado puede ser vehículo de transmisión de patógenos, incluyendo HIV, HVC y HTLV. Debemos tener en cuenta, además, que los tests de que disponemos son capaces de detectar los patógenos conocidos a día de hoy, pero en cualquier momento podrían aparecer otros nuevos, intra o extracelulares, no detectables hasta el conocimiento de la enfermedad que transmitan y se desarrollen los tests de detección fiables, algo parecido a lo que ocurrió con el VIH durante los primeros años de la década de los 80 (9) .

Por otra parte, la aplicación de bajas dosis de calor (hasta 60º C y hasta 10 horas) destruye bacterias y virus patógenos sin alterar las propiedades mecánicas ni la efectividad clínica (3, 6, 12, 16, 21, 24, 30, 32, 35-37) .

La revisión... [Seguir leyendo]

1. MÉTODO PARA EL PROCESAMIENTO DEL TEJIDO ÓSEO ALOGÉNICO, caracterizado porque comprende cuatro procedimientos o fases de aplicación sucesiva consistentes en:

- Lavado de cada aloinjerto de manera individualizada, en recipiente hermético y sumergido en suero fisiológico a 60º centígrados de temperatura, en condiciones de esterilidad, con una duración de 10 minutos, y seguido de agitación manual enérgica durante 1 minuto en el mismo recipiente hermético de lavado.

- Centrifugación de cada aloinjerto óseo de manera individualizada, manteniendo las condiciones de esterilidad, a 2.000 revoluciones por minuto (1.500 g) en centrifugadora de laboratorio durante 15 minutos.

- Pasteurización de cada aloinjerto óseo de manera individualizada, con la finalidad de destruir mediante calor hongos y bacterias patógenas, para lo cual se introduce en un recipiente estéril de cierre hermético, con código de identificación individual para cada aloinjerto, añadiendo suero fisiológico precalentado a 60º centígrados hasta cubrir por completo el injerto óseo, agitándose durante 90 minutos.

- Control microbiológico final, para lo cual, bajo campana de flujo laminar con condiciones de esterilidad, se hace pasar el suero en el que se realizó la pasteurización a través de un filtro de papel con tamaño de poro de 0, 45 μm, cultivando directamente el filtro en medio de cultivo para microorganismos aerobios, anaerobios y hongos.

2. MÉTODO PARA EL PROCESAMIENTO DEL TEJIDO ÓSEO ALOGÉNICO, según la reivindicación 1, caracterizado porque en la fase de pasteurización, los recipientes se introducen en grupos de cuatro en una termoagitadora de laboratorio con control de temperatura y velocidad de agitación, programándose el procedimiento a 60º centígrados y a una velocidad de agitación orbital de 40 ciclos por minuto.

3. RECIPIENTE para llevar a cabo un método para el procesamiento del tejido óseo alogénico como el descrito en la reivindicación 1 ó 2, concretamente para llevar a cabo la etapa de centrifugación comprendida en dicho método, caracterizado porque consiste en un recipiente diseñado y construido específicamente para este procedimiento en PVC resistente a autoclave, con rejilla en su parte inferior para permitir la salida de los materiales a eliminar y mantenerlos separados del aloinjerto durante la centrifugación.

4. RECIPIENTE, según la reivindicación 3, caracterizado porque dicho recipiente tiene las siguientes dimensiones: MEDIDAS EXTERIORES. Altura: 120 milímetros. Anchura: 99 milímetros. Rosca de cierre: 6 espiras con paso de rosca de 5 milímetros. MEDIDAS INTERIORES. Profundidad: 97 milímetros (con rejilla colocada: 82 milímetros) . Anchura: 76 milímetros. MEDIDAS DE LA REJILLA. Altura: 15 milímetros. Anchura: 74, 5 milímetros. Diámetro de los orificios: 6 milímetros.