MÉTODO DE ENSAYO DE INHIBICIÓN Y DISPOSITIVO PARA LA DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS.

Método de ensayo de inhibición y dispositivo para la detección de antibióticos Los antibióticos usados en los piensos para animales o para tratar animales de granja, tales como ganado para leche o carne y ganado porcino, ocasionalmente contaminan la cadena alimentaria. Los peligros asociados a estos residuos no deseados incluyen reacciones alérgicas, propagación de organismos resistentes y otros riesgos para la salud a largo plazo. Como consecuencia, agencias gubernamentales como el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y la FDA (Food and Drug Administration) de los Estados Unidos exigen la monitorización de dichos residuos en los alimentos. Alimentos tales como la leche, la carne, el pollo, el marisco y los piensos para animales se evalúan de forma rutinaria para determinar la posible presencia de estos residuos. En la presente memoria nosotros describimos un método cómodo de usar para detectar una serie de residuos en un único ensayo de amplio espectro. Se pueden evaluar diversas partes y excreciones de animales para determinar la presencia de antibióticos. Los ensayos de antibióticos en riñón incluyen ensayos para riñón de cerdo y riñón de ternero. Los problemas de algunos de los ensayos disponibles, particularmente en la industria porcina, incluyen sensibilidades que no coinciden bien con los límites gubernamentales o de la industria. Algunos ensayos son demasiado sensibles para determinados antibióticos y poco sensibles para otros. Las sensibilidades de los ensayos de inhibición de crecimiento microbiano disponibles actualmente se basan principalmente en parámetros que afectan la sensibilidad del ensayo a todos los fármacos. Dichos parámetros incluyen el organismo de crecimiento usado, la cantidad o la concentración de organismo de crecimiento usado, las dimensiones del recipiente, el volumen de medio, el tipo de medio, la mezcla de nutrientes, el tiempo y la temperatura de incubación. Como consecuencia, si un ensayo es adecuadamente sensible a algunos fármacos, pero demasiado sensible a otros fármacos, puede que se necesiten otros métodos para ajustar la sensibilidad. Otro problema de algunos ensayos es que pueden requerir procedimientos de extracción incómodos o el uso de disolvente orgánicos que deben ser eliminados de la muestra antes de la operación del ensayo. Esto añade una etapa de procedimiento incómoda. Algunos ensayos también son incómodos de llevar a cabo, ya que requieren la incubación de un bastoncillo de algodón de muestreo en un lecho de cultivo bacteriano y la inoculación de una superficie de agar con esporas justo antes de llevar a cabo el ensayo. Además de los problemas de tiempo de ensayo elevado, sobre-sensibilidad, sub-sensibilidad y extracción, ninguno de los ensayos disponibles actualmente se proporcionan en un formato todo-en-uno, en el que todos los reactivos del ensayo y todos los dispositivos de muestreo se encuentren en un único instrumento de ensayo. Resumen En la presente memoria nosotros describimos varias realizaciones de un aparato de ensayo y de un método para detectar antibióticos en una muestra de ensayo usando la inhibición del crecimiento de un cultivo microbiano. Algunas realizaciones incluyen todos los reactivos para un cultivo microbiano en un formato listo para usar. El cultivo puede incluir, por ejemplo, nutrientes, agar, uno o más tampones, esporas e indicador de color. Alternativamente, uno cualquiera de dichos componentes, o más de uno, pueden proporcionarse separadamente, por ejemplo en un compartimento de reactivos separado, denominado de aquí en adelante compartimento. En una realización del formato listo para usar, el usuario sólo tiene que añadir la muestra, o extracto de muestra, e incubar durante un periodo de tiempo prescrito, por ejemplo de aproximadamente 1,5 a 4 horas, a una temperatura prescrita, por ejemplo de aproximadamente 55-70 grados Celsius, y observar los resultados. Si se requiere una extracción, se puede proporcionar un agente de extracción por separado del resto de reactivos. En un ejemplo, el agente de extracción se encuentra en un compartimento. El compartimento que contiene el agente de extracción se puede incluir en una unidad de ensayo que incluya al resto de componentes de ensayo. La unidad de ensayo puede incluir el compartimento contenido dentro de un vial unido al fondo de la unidad de ensayo. Los cierres del compartimento pueden ser cierres de una membrana permeable a una aguja, tal como cierres de lámina metálica o cierres tipo lámina o cierres de plástico o similares. El pinchado de los cierres permite que el agente de extracción entre en contacto con el cultivo. El usuario sólo tiene que añadir la muestra al agente de extracción, poner en contacto la muestra extraída con el cultivo e incubar durante el periodo de tiempo prescrito a la temperatura prescrita. El agente de extracción puede ser una disolución tamponante capaz de extraer fármacos antimicrobianos de una muestra de riñón, tal como una muestra de riñón bovino o porcino. El agente de extracción también puede ser un reactivo utilizado simplemente para retirar la muestra de un bastoncillo de algodón de muestreo y transferirla al cultivo. Algunas realizaciones incluyen dos o más tampones (denominados de aquí en adelante politampón) que tienen múltiples valores de pKa. Un politampón puede mejorar la estabilidad antes del ensayo y/o después del ensayo del cultivo, así como otros aspectos del comportamiento del ensayo. La estabilidad después del ensayo permite que los resultados se mantengan a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo extendido, por ejemplo de 6-8 horas o más, sin ningún cambio en el resultado del ensayo. El politampón puede premezclarse con el cultivo o puede proporcionarse por separado, tal como en un compartimento diferente para una adición posterior. 2   La siguiente descripción describe la reducción de la sensibilidad del cultivo microbiano frente a ciertos inhibidores de crecimiento de cultivo. En algunos ensayos de inhibición del crecimiento, se puede usar la inhibición de cultivo microbiano mediante antibióticos procedentes de una muestra, o revertir dicha inhibición, como mecanismo de monitorización de antibióticos. La sensibilidad de dichos ensayos se puede ajustar poniendo en contacto el cultivo con al menos un reactivo de ajuste. Los ejemplos de reactivos de ajuste incluyen proteínas de unión, enzimas, análogos químicos y/o anticuerpos que se unan a antibióticos, o que inhiban su eficacia. El reactivo de ajuste se puede usar para ajustar la sensibilidad del ensayo para al menos un antibiótico u otro inhibidor de crecimiento de cultivo. Un ejemplo de enzima microbiana útil como ligando de ajuste es un receptor/ligando antibiótico procedente de la pared celular de microbios tales como Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus (B. st.). El reactivo de ajuste se puede aplicar de varias formas, por ejemplo combinado con un cultivo o caldo, aplicado en la parte superior de un cultivo sólido, tal como una matriz de agar, añadido sobre un bastoncillo de algodón de muestreo o contenido en un tampón de dilución. Los posibles reactivos de ajuste incluyen receptores/ligandos de antibióticos aislados de bacterias, anticuerpos monoclonales y policlonales. Cuando el reactivo de ajuste es un ligando de antibiótico, tal como una proteína de unión, por ejemplo un receptor o anticuerpo de antibiótico bacteriano, el reactivo de ajuste puede reducir la disponibilidad de antibióticos capaces de inhibir el crecimiento del cultivo particular usado, como mediante unión al antibiótico. De forma similar, los reactivos de ajuste pueden incluir sustancias que, más que unirse al antibiótico, reducen la influencia del antibiótico sobre el organismo de crecimiento. Algunas realizaciones incluyen un aparato de ensayo con un cultivo sólido o semisólido en el interior de un vial. El cultivo puede incluir todos o parte de los productos bioquímicos del ensayo, que incluyen agar, nutrientes, indicadores de color, uno o más tampones y esporas. En una realización, el cultivo, antes de la adición de la muestra de ensayo, se ajusta a un pH superior a aproximadamente 8. Dicho pH puede ayudar a evitar la contaminación del cultivo, por ejemplo con moho, y prolongar el periodo de caducidad pre-ensayo. El vial puede incluir un extremo de fondo sellado y un sello de membrana sobre el extremo superior. En la operación del ensayo el usuario puede pinchar el sello con, por ejemplo, una punta de pipeta y a continuación dispensar la muestra, por ejemplo una muestra de 200 microlitros de leche, al interior del vial. Algunas realizaciones incluyen la unidad de ensayo completa que contiene todos los reactivos, premezclados juntos y listos para ser usados en un cultivo y, además, un instrumento de muestreo, tal como un bastoncillo de algodón o sonda y un agente de... [Seguir leyendo]

1.- Un método para reducir la sensibilidad frente a una familia de antibióticos de beta-lactama de un ensayo de inhibición de crecimiento microbiano para detectar la presencia de inhibidores microbianos en una muestra, que comprende: a) preparar un cultivo microbiano que presentará inhibición de crecimiento cuando se ponga en contacto con un antibiótico de beta-lactama; b) añadir una proteína de unión de beta-lactama al cultivo; c) añadir la muestra al cultivo; d) desarrollar el cultivo; e) cuantificar el crecimiento de cultivo, en donde la falta de crecimiento de cultivo refleja la presencia de un inhibidor de crecimiento microbiano y en donde la sensibilidad del ensayo a la familia de beta-lactamas se reduce añadiendo proteína de unión de betalactama. 2.- El método de la reivindicación 1 que además comprende extraer el antibiótico de la muestra y añadir el extracto al cultivo. 3.- El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de unión de beta-lactama se combina con la muestra antes o después de añadir la muestra al cultivo. 4.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la proteína de unión de beta-lactama se añade al cultivo antes o después de añadir la muestra al cultivo. 5.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo microbiano comprende esporas. 6.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende añadir al cultivo microbiano al menos dos tampones, en donde uno de dichos al menos dos tampones tiene un pKa por encima de 7 y el otro de dichos tampones tiene un pKa inferior a 7. 7.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el pH del cultivo microbiano, antes de añadir la muestra, está por encima de aproximadamente pH 8,0. 8.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cuantificación del crecimiento del cultivo comprende determina un cambio en el pH del cultivo. 9.- El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de unión de beta-lactama procede de un organismo del género Bacillus. 10.-El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de unión de beta-lactama procede de la familia microbiana presente en el cultivo microbiano. 13   14     16   17   18   19