Una célula vegetal que comprende en sus cloroplastos actividades enzimáticas para convertir el glicolato enmalato,

en donde dicha célula vegetal comprende en sus cloroplastos un primer polipéptido que tiene actividad deglicolato oxidasa, un segundo polipéptido que tiene actividad de malato sintasa y un tercer polipéptido que tieneactividad de catalasa.

Medios para mejorar los rasgos agrobiológicos en una planta, proporcionando una célula vegetal que comprende en sus cloroplastos actividades enzimáticas para convertir el glicolato en malato.

La presente invención se refiere a la mejora de rasgos agricobiológicos en plantas. Más específicamente, se relaciona con una célula vegetal que comprende en sus cloroplastos actividades enzimáticas para convertir el glicolato en malato, en donde dicha célula vegetal comprende un primer polipéptido que tiene actividad de glicolato oxidasa, un segundo polipéptido que tiene actividad de malato sintasa y un tercer polipéptido que tiene actividad de catalasa. También se abarca una planta que comprende dichas células vegetales, así como semillas que se obtienen de las citadas plantas. La presente invención, además, se relaciona con un método para producir una planta transgénica o una célula vegetal que tiene una mayor eficiencia en el uso del agua o un rendimiento mayor. La presente invención contempla los polinucleótidos que comprenden una combinación de ácidos nucleicos que codifica los polipéptidos mencionados anteriormente, así como vectores que comprenden los polinucleótidos y los usos de estos.

La asimilación de CO2 fotosintético en plantas C3 se limita por variables ambientales incluyendo temperatura, disponibilidad de agua y CO2. Gran parte de esta limitación, se puede atribuir a las propiedades catalíticas de ribulosa 1, 5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (RubisCO) . Ambos O2 y O2 atmosférico producido por el fotosistema II compiten con el CO2 por el enlace con el sitio activo de RubisCO. La oxigenación de la ribulosa 1, 5-bisfosfato (RuBP) produce solo una molécula de 3-P glicerato, y los restantes dos carbonos forman 2-P glicolato. Este 2-P glicolato es el sustrato inicial del ciclo fotosintético C2-oxidativo (el ciclo fotorespiratorio) que conduce a la pérdida de CO2 [1].

La primera función del ciclo fotorespiratorio es salvar el 2-P glicolato (Figura 1) . En el curso de esta ruta, dos moléculas de 2-P glicolato se metabolizan para formar una molécula de cada uno 3-P glicerato y CO2, y estos compuestos de carbono se utilizan inmediatamente para la regeneración de RuBP vía el ciclo de Calvin-Benson (el ciclo fotosintético C3-reductivo) sin la síntesis neta de triosas fosfatos [2, 3].

El 2-P glicolato se metaboliza en tres compartimientos celulares distintos a saber, cloroplastos, peroximas, y mitocondrias (el sitio de la liberación de CO2 y NH4+) , involucrando numerosas reacciones enzimáticas y procesos de transporte (Figura 1) . La vía de fotorespiración se basa en la estrecha integración del metabolismo de carbono y nitrógeno en la hoja, porque el NH4+ se libera a la misma velocidad que el CO2 [4]. Dado que el nitrógeno es un recurso más valioso que el carbono, la re asimilación del NH4+ fotorespirado es esencial para mantener el estado del nitrógeno en las plantas C3 [5]. El amoníaco liberado en la matriz de mitocondrias durante el curso de la oxidación de la glicina se utiliza en el cloroplasto por la glutamina sintetasa (GS) que cataliza la conversión de ATP dependiente del glutamato a la glutamina. El glutamato sintasa dependiente de ferredoxina (GOGAT) , localizado exclusivamente en los cloroplastos de células mesofílicas, cataliza la conversión de la glutamina y 2-oxoglutarato a dos moléculas de glutamato (Figura 1) .

Uno de los enfoques para mejorar la actividad de carboxilación de RubisCO, sería alterar las constantes cinéticas de RubisCO para CO2 y O2. Sin embargo, la ingeniería genética de RubisCO mediante mutagénesis de sitio dirigido para disminuir su actividad oxigenasa o su reemplazo con formas más eficientes, como aquellas de las algas rhodophyte en las cuales el factor de especificidad CO2/O2 es superior que el de la planta RubisCO superior, era hasta ahora de éxito limitado [6]. Otro enfoque para mejorar la fijación del carbono C3 sería reducir fotorespiración directamente mediante la manipulación de enzimas en esta vía. A partir del análisis de mutantes de inserción se demostró que el bloqueo del procesamiento en cadena del metabolismo de fotorespiración de oxigenación de RubisCO es letal [7-13]. Estos resultados sugieren que la fotosíntesis es poco probable que se mejore por manipulación directa de niveles de enzimas en la vía de fotorespiración. Por otro lado, han evolucionado varios modos de aumentar la actividad de la carboxilasa de RubisCO, mejorando la concentración actual de CO2 en su sitio de acción. Ejemplos son los mecanismos de concentración de CO2 de cianobacterias y algas [14-15] o el ciclo fotosintético de plantas C4 [16]. Este último proporciona una bomba de CO2, que conduce a un aumento de la relación CO2/O2 en el sitio de RubisCO y por lo tanto da como resultado una disminución de la actividad de la oxigenasa relativa a la actividad de la carboxilasa. En las plantas C3, RubisCO opera in vivo a aproximadamente 25% de su Vmax mientras se cree que operan en o cerca a su Vmax en plantas C4 [16]. Además, las actividades específicas de RubisCO son mayores en las plantas C4, en comparación con las plantas C3; por lo tanto menos proteína de RubisCO se necesita para lograr altas tasas de fotosíntesis en las plantas C4. En consecuencia y debido al hecho que RubisCO es una enzima que consume N (20-30% del N de hojas totales en las plantas C3, pero solo 6% en las plantas C4) , las plantas C4 muestran una mayor eficiencia del uso de nitrógeno sintético que las plantas C3 [17]. Se realizaron intentos para transferir las ventajas de fotosíntesis de C4 como alta capacidad fotosintética, crecimiento rápido, y aumento de las eficiencias del uso de agua y nitrógeno por sobreexpresión de enzimas del ciclo C4 en las plantas C3 tales como A. thaliana, patata, tabaco y arroz [18-21]. Häusler et al. [21], han demostrado que la sobreexpresión de los genes del ciclo C4 en las plantas C3 (patata y tabaco) conduce a una atenuación de la fotorespiración pero también a cambios en el patrón de enzimas endógenas y contenidos de protectores UV. Recientemente, se demostró una atenuación del flujo a través de la fotorespiración completando la vía con ambas la glioxilato carboligasa y tartronato semialdehido reductasa a partir de E. coli [22]. El ciclo fotorespiratorio no solo es un proceso derrochador que resulta inevitablemente de las propiedades cinéticas de RubisCO. También se puede considerar como un mecanismo de protección para las plantas C3 expuestas a altas temperaturas y sequía. Para mencionar están la generación de metabolitos, tales como glicina, serina o unidades de un carbono, que se pueden exportar de la hoja o utilizar en otras vías metabólicas, por ejemplo glicina para la síntesis de glutatión [23, 24] y la prevención de la excesiva sobre-reducción de la cadena de transporte de electrones disipando la energía de la luz, en particular cuando las plantas C3 se exponen a intensidades de luz altas o a estrés por sequía (fotoprotección; [25, 26]) .

WO 03/100066 revela una célula vegetal que comprende en sus cloroplastos actividades enzimáticas para convertir el glicolato en glicerato. La célula vegetal mostró una fotorespiración disminuida, una mayor asimilación de CO2, aumento de la biomasa y mayor eficiencia en el uso del agua. El documento no revela la conversión de glicolato a malato.

Existe una necesidad de mejorar la asimilación de CO2 en plantas y, en particular en las plantas C3, con el fin de mejorar los rasgos agricobiológicos de plantas de cultivo. Sin embargo, al mismo tiempo los inconvenientes mencionados anteriormente serán evitados.

En consecuencia, el problema técnico fundamental de la presente invención podría considerarse como la provisión de medios y métodos para cumplir con las necesidades mencionados anteriormente. El problema técnico se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones 1 a 29.

De esta manera, la presente invención se relaciona con una célula vegetal que comprende en sus cloroplastos actividades enzimáticas para convertir el glicolato en malato, en donde dicha célula vegetal comprende en sus cloroplastos un primer polipéptido que tiene actividad de glicolato oxidasa, un segundo polipéptido que tiene actividad de malato sintasa y un tercer polipéptido que tiene actividad de catalasa.

El término “célula vegetal” como se utiliza en este documento abarca las células de todos los tipos del tejido de la planta, i.e. a partir de hojas, raíces, tallos, tejido vascular, tallos, callos, cotiledones, tallos, anteras, peciolos, semillas o tejido embrionario de la planta. La célula huésped de... [Seguir leyendo]

1. Una célula vegetal que comprende en sus cloroplastos actividades enzimáticas para convertir el glicolato en malato, en donde dicha célula vegetal comprende en sus cloroplastos un primer polipéptido que tiene actividad de glicolato oxidasa, un segundo polipéptido que tiene actividad de malato sintasa y un tercer polipéptido que tiene actividad de catalasa.

2. La célula vegetal de la reivindicación 1, en donde dicho primer polipéptido se codifica por un primer polinucleótido que comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de:

a. un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como se muestra en SEQ ID No: 1;

b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID No: 2;

c. un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido, que es al menos 50% idéntica a la secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID No: 1, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de glicolato oxidasa; y

d. un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 50% idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID No: 2, en donde dicho polipéptido tiene actividad de glicolato oxidasa.

3. La célula vegetal de la reivindicación 1 o 2, en donde dicho segundo polipéptido se codifica por un segundo polinucleótido que comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de:

a. un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como se muestra en SEQ ID No: 3;

b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID No: 4;

c. un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido, que es al menos 40% idéntica a la secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID No: 3, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de malato sintasa; y

d. un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 40% idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID No: 4, en donde dicho polipéptido tiene actividad de malato sintasa.

4. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el tercer polipéptido se codifica por un tercer polinucleótido que comprende un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de:

a. un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido como se muestra en SEQ ID No: 5;

b. un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID No: 6;

c. un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido, que es al menos 70% idéntica a la secuencia de nucleótido mostrada en SEQ ID No: 5, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de catalasa; y

d. un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que tiene una secuencia de aminoácido que es al menos 50% idéntica a la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID No: 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de catalasa.

5. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho primer polipéptido se expresa a partir de un polinucleótido heterólogo.

6. La célula vegetal de la reivindicación 5, en donde dicho polinucleótido heterólogo comprende un ácido nucleico según se define en la reivindicación 2.

7. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho segundo polipéptido se expresa a partir de un polinucleótido heterólogo.

8. La célula vegetal de la reivindicación 7, en donde dicho polinucleótido heterólogo comprende un ácido nucleico según se define en la reivindicación 3.

9. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho tercer polipéptido se expresa a partir de un polinucleótido heterólogo.

10. La célula vegetal de la reivindicación 9, en donde dicho polinucleótido heterólogo comprende un ácido nucleico según se define en la reivindicación 4.

11. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha célula vegetal además comprende una enzima NADP-málica y una piruvato deshidrogenasa.

12. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha célula vegetal tiene una mayor eficiencia de asimilación de CO2 en comparación con una célula vegetal que carece de actividades enzimáticas para convertir el glicolato en malato.

13. La célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicha célula vegetal es una célula de una planta C3.

14. Una planta que comprende la célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. La planta de la reivindicación 14, en donde dicha planta tiene una mayor asimilación de CO2 en comparación con una planta que carece de una célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

16. La planta de la reivindicación 14 o 15, en donde dicha planta tiene una fotorespiración atenuada en comparación con una planta que carece de una célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

17. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde dicha planta tiene una mayor eficiencia del uso del agua en comparación con una planta que carece de una célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a

13.

18. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde dicha planta produce un número mayor de hojas en comparación con una planta que carece de una célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

19. La planta de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde dicha planta tiene un rendimiento mayor en comparación con una planta que carece de una célula vegetal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

20. Una semilla que se obtiene de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en donde dicha semilla es capaz de generar una planta de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19.

21. Un método para producir una planta transgénica o una célula vegetal que tiene una mayor eficiencia en el uso del agua en comparación con una planta no-transgénica o célula vegetal correspondiente, dicho método comprende la introducción en los cloroplastos de la planta transgénica o célula vegetal de un primer polipéptido, un segundo polipéptido y un tercer polipéptido, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha planta transgénica o célula vegetal se produce por transformación.

22. Un método para producir una planta transgénica o célula vegetal que tiene un rendimiento mayor en comparación con una planta no-transgénica o célula vegetal correspondiente, dicho método comprende la introducción en los cloroplastos de la planta transgénica o célula vegetal de un primer polipéptido, un segundo polipéptido y un tercer polipéptido, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha planta transgénica o célula vegetal se produce por transformación.

23. El método de las reivindicaciones 21 o 22, en donde dicho método comprende las etapas de:

a. la introducción de al menos un polinucleótido heterólogo que codifica los citados polipéptidos en la planta o la célula vegetal; y

b. la expresión de dichos polipéptidos a partir de al menos un polinucleótido citado.

24. Un polinucleótido que comprende en combinación un ácido nucleico según se define en la reivindicación 2, un ácido nucleico según se define en la reivindicación 3 y un ácido nucleico según se define en la reivindicación 4.

25. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 24.

26. El vector de la reivindicación 25, en donde dicho vector es un vector de expresión.

27. Una composición que comprende un primer polinucleótido según se define en la reivindicación 2, un segundo polinucleótido según se define en la reivindicación 3 y un tercer polinucleótido según se define en la reivindicación 4.

28. Uso del polinucleótido de la reivindicación 24, el vector de la reivindicación 25 o la composición de la reivindicación 27, para conferir mayor eficiencia en el uso del agua a una planta o célula vegetal.

29. Uso del polinucleótido de la reivindicación 24, el vector de la reivindicación 25 o la composición de la reivindicación 27 para conferir un rendimiento mayor a una planta o célula vegetal.

Figura 1.

Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.