Medios para cromatografía de intercambio iónico sobre membrana.

Un medio sorbente poroso que comprende un sustrato que tiene un primer lado externo y un segundo lado externo,

siendo ambos lados porosos, y un espesor poroso entre ellos, siendo dicho sustrato hidrófilo y teniendo un material sorbente recubriendo sustancialmente la matriz sólida del sustrato y dichas primera y segunda superficies externas, comprendiendo dicho material sorbente un polímero reticulado que tiene grupos amonio cuaternarios unidos a través de un grupo enlazante no polar.

Medios para cromatografia de intercambio iónico sobre membrana Esta solicitud de patente reivindica la prioridad sobre la solicitud de patente provisional de EE.UU. con numero de serie: 61/003 694 registrada el 19 de Noviembre de 2007, cuya descripción se incorpora en este texto como 5 referencia.

Antecedentes de la invención La purificación de virus es un campo emergente de las bioseparaciones. Ya que son necesarias grandes cantidades de virus puros para estudios clinicos de terapias genicas, el metodo tradicional de purificación, concretamente, la ultracentrifugación, ya no es rentable. Existe una necesidad de desarrollar mas rapidamente, de manera menos 10 cara, y mas tecnicas de purificación escalables. Se ha empleado la cromatografia para la purificación de virus, primeramente en el formato de esferas. Los primeros informes sobre la purificación de virus basada en la cromatografia data de aproximadamente medio siglo (vease, por ejemplo, Haruna, I.; Yaoi, H.; Kono, R.; Watanabe. I.; Separation of adenovirus by chromatography on DEAE-cellulose. Virology 1961, 13, (2) , 264) . La cromatografia de membrana ha empezado a ganar atención recientemente cuando las limitaciones de capacidad y de uso de la cromatografia sobre esferas se hicieron mas serios.

Los fuertes intercambiadores de aniones, tal como los basados en iones de amonio cuaternario, se usan en procesamientos posteriores como un medio limpiador para capturar grandes impurezas cargadas negativamente, tal como endotoxinas, virus, acidos nucleicos, y proteinas de celulas huesped (HCP por sus siglas en ingles) que estan presentes en fluidos como fluidos biológicos, particularmente soluciones de sustancias bioterapeuticas fabricadas.

Tradicionalmente, los intercambiadores de aniones se han ofrecido y usado en el formato de esferas, por ejemplo Q Sepharose® disponible en GE Healthcare Bio-Sciences AB. Sin embargo, las limitaciones de producción de los sistemas basados en esferas requieren columnas de gran volumen para capturar eficazmente las impurezas.

En la cromatografia sobre esferas, la mayoria del area superficial disponible para la adsorción es interna a la esfera. Por consiguiente, el proceso de separación es inherentemente lento ya que el flujo de transporte de masa esta 25 controlado tipicamente por la difusión en los poros. Para minimizar esta resistencia a la difusión y concomitantemente maximizar la capacidad de unión dinamica, se pueden emplear esferas de diametro pequeno. Sin embargo, el uso de esferas de diametro pequeno implica una perdida de carga mayor en la columna. Consecuentemente, la optimización de las separaciones cromatograficas preparativas a menudo implica un compromiso entre eficacia/capacidad dinamica (esferas pequenas favorecidas) y perdida de carga en la columna (esferas grandes favorecidas) .

En contraste, los sistemas de cromatografia sobre membrana (tambien llamada membrana sorbente) tienen los ligandos anclados directamente a los poros de convección de la membrana, eliminando de este modo los efectos de la difusión interna en los poros sobre el transporte de masa. Adicionalmente, el uso de los sustratos de membrana microporosa con una distribución ajustada de tamano de poro de la membrana asociado con distribuidores de flujo 35 eficaces puede minimizar la dispersión axial y proporcionar una utilización uniforme de todos los sitios activos. Consecuentemente, los flujos de transferencia de masa de medios sorbentes de la membrana pueden ser un orden de magnitud mayor que la de los medios de cromatografia estandar sobre esferas, permitiendo en ambos una alta eficacia y separaciones de con flujo elevado. Ya que las columnas unicas o incluso las dispuestas en serie son muy delgadas comparadas con las columnas empaquetadas con medios basados en esferas, las perdidas de carga 40 reducidas se encuentran a lo largo del lecho cromatografico, de este modo se consiguen caudales y productividades mayores. La necesaria capacidad de unión se alcanza empleando membranas de area superficial interna suficiente, dando configuraciones de dispositivos de diametro muy grande frente a relaciones de alturas (d/h) . Ya que la mayoria de la capacidad de las esferas para cromatografia es interna a la esfera, los sistemas de cromatografia sobre membrana ganan ventaja sobre los de esferas a medida que el tamano de las entidades adsorbentes 45 aumentan (como, por ejemplo, yendo de una molecula de proteina a una particula de virus) .

Los sorbentes de membrana apropiadamente disenados tienen eficacias cromatograficas que son 10-100 veces mejores que las resinas de esferas preparativas estandar. Consecuentemente, para conseguir el mismo nivel de separación sobre un sorbente de membrana, se puede utilizar una altura de lecho 10 veces menor. Las longitudes de lecho de 1-5 mm son estandar para sorbentes de membrana, comparado con las alturas de lecho de 10-30 cm 50 para sistemas de esferas. Debido a las relaciones de aspecto de columna extremo requerido para los sorbentes de membrana de gran volumen, el diseno del dispositivo es critico. Para mantener las ventajas de la eficacia inherente asociadas con sorbentes de membrana, se requieren unos distribuidores de entrada y salida para utilizar eficientemente y eficazmente el volumen de membrana disponible. La tecnologia de sorbente de membrana es adecuada idealmente para esta aplicación. Los sorbentes de membrana comerciales habituales, sin embargo, sufren 55 varios inconvenientes, incluido la baja capacidad, mala separación de impurezas, y dificultad en la elución del material purificado.

La absorción se refiere a abordar el asunto mediante permeación en el cuerpo de un material absorbente. La absorción se refiere al movimiento de las moleculas desde la fase libre sobre la superficie de un medio adsorbente.

La sorción es un termino general que incluye ambas adsorción y absorción. Similarmente, un material sorbente o un dispositivo de sorción en este texto denominado como un sorbente, se refiere a un material o dispositivo que bien ad-o absorbe o ambos ad-y absorbe.

Un sorbente de membrana es un medio altamente poroso interconectado que tiene la habilidad de retirar (ad-y/o adsorber) algunos componentes de una solución cuando esta fluye a traves de sus poros. Las propiedades del sorbente de membrana y su habilidad para funcionar adecuadamente en la aplicación requerida depende de la estructura porosa del medio (esqueleto) al igual que de la naturaleza de la superficie que esta expuesta a la solución. Tipicamente, el medio poroso se forma primero, a partir de un polimero que no se disuelve o se hincha en agua y posee unas propiedades mecanicas aceptables. El medio poroso es preferentemente una hoja de membrana porosa fabricada por metodos de separación de fase bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Zeman LJ, Zydney AL, Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, Nueva York: Marcel Dekker, 1996. Tambien son aceptables esqueletos de membranas tubulares y de fibra hueca. Habitualmente se requiere una etapa de un procesamiento separado para modificar las superficies externas o faciales y las superficies internas de los poros de la estructura porosa formada para impartir las propiedades adsorbentes necesarias. Ya que la estructura de la membrana se forma a menudo a partir de un polimero hidrof6bico, otro propósito de la etapa de modificación de la superficie es tambien hacer las superficies hidrófilas, o humectables al agua.

Esta invención se refiere a un medio de cromatografia de intercambio aniónico disenado para purificar virus, tal como adenovirus. El adenovirus es un vector de elección en estudios de terapia genica. Es estable, sin envoltura, e infecta celulas facilmente. El serotipo mas comun se denomina Ad5. Se expresa facilmente en el laboratorio, pero requiere una purificación minuciosa a partir de proteinas celulares para evitar las senales de falsos positivos en posteriores estudios de transfección. Por supuesto, tambien se requiere adenovirus puro para sus aplicaciones ultimas, es decir, terapia genica y vacunación. Estudios electroforeticos muestran que Ad5 esta fuertemente cargado negativamente a pH alrededor de 8, mientras muchas especies en la suspensión del lisado celular tiene carga mas debil a este pH. Esto hace que la cromatografia de intercambio aniónico sea una tecnica adecuada para la purificación de Ad5.

Las membranas de intercambio aniónico para la retirada y purificación de virus han sido preparadas previamente por tecnica de injerto quimico como se explica en la patente de EE.UU. 7 160 464. Se explica la preparación de una membrana injertada como cadenas laterales polimericas... [Seguir leyendo]

1. Un medio sorbente poroso que comprende un sustrato que tiene un primer lado externo y un segundo lado externo, siendo ambos lados porosos, y un espesor poroso entre ellos, siendo dicho sustrato hidrófilo y teniendo un material sorbente recubriendo sustancialmente la matriz sólida del sustrato y dichas primera y segunda superficies externas, comprendiendo dicho material sorbente un polimero reticulado que tiene grupos amonio cuaternarios unidos a traves de un grupo enlazante no polar.

2. El medio sorbente poroso de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato comprende una membrana microporosa.

3. El medio sorbente poroso de la reivindicación 2, en el que dicha membrana comprende una poliolefina.

4. El medio sorbente poroso de la reivindicación 3, en el que dicha poliolefina es polietileno.

5. El medio sorbente poroso de la reivindicación 1, en el que dicho sustrato es una membrana de polietileno de peso molecular altisimo.

6. El medio recubierto poroso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polimero reticulado comprende polietilenimina.

7. El medio recubierto poroso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polimero reticulado esta modificado con un agente modificador de la carga que comprende un compuesto organico que tiene grupos amonio cuaternarios conectados por dicho grupo enlazante no polar a un resto capaz de reaccionar con dicho polimero reticulado.

8. El medio recubierto poroso de la reivindicación 7, en el que dicho compuesto organico tiene la fórmula Y-Z-N (CH3) 3+X-, en la que Y es un grupo saliente reactivo, Z es un enlace aromatico o alifatico no polar, y X es un ion cargado negativamente de un acido soluble en agua.

9. El medio recubierto poroso de la reivindicación 8, en el que Y es un miembro elegido entre el grupo que consiste en Br-, Cl-, I-, TsO-, y CF3SO3-, y Z es (CH2) n donde n es de 2 a 10.

10. El medio recubierto poroso de la reivindicación 6, en el que los grupos amonio cuaternarios se forman sobre dicha polietilenimina mediante bromuro de 3-bromopropiltrimetilamonio.

11. Un metodo para purificar virus, que comprende pasar una solución que comprende dicho virus a traves de una membrana para adsorber dicho virus, comprendiendo dicha membrana un sustrato que tiene un primer lado externo y un segundo lado externo, siendo ambos lados porosos, y un espesor poroso entre ellos, siendo dicho sustrato hidrófilo y tendiendo un material sorbente sustancialmente recubriendo la matriz sólida del sustrato y dichas primera y segunda superficies externas, comprendiendo dicho material sorbente un polimero reticulado que tiene grupos amonio cuaternarios unidos a traves de un grupo enlazante no polar; lavar dicha membrana con tampón, y eluir dicho virus fuera de dicha membrana.

12. El metodo de la reivindicación 11, en el que dicho polimero reticulado se modifica con un agente modificador de la carga que comprende un compuesto organico que tiene grupos amonio cuaternarios conectados por dicho grupo enlazante no polar a un resto capaz de reaccionar con dicho polimero reticulado.

13. El metodo de la reivindicación 12, en el que dicho compuesto organico tiene la fórmula Y-Z-N (CH3) 3+X-, en la que Y es un grupo saliente reactivo, Z es un grupo enlazante aromatico o alifatico no polar, y X es un ion cargado negativamente de un acido soluble en agua monovalente.

14. Un intercambiador de aniones que comprende un medio sorbente poroso que comprende un sustrato que tiene un primer lado externo y un segundo lado externo, siendo ambos lados porosos, y un espesor poroso entre ellos, siendo dicho sustrato hidrófilo y tendiendo un material sorbente recubriendo sustancialmente la matriz sólida del sustrato y dichas primera y segunda superficies externas, comprendiendo dicho material sorbente un polimero reticulado que tiene grupos amonio cuaternarios unidos a traves de un grupo enlazante no polar.