Medio de cultivo exento de suero para la producción de gonadotropinas recombinantes.

Uso de un medio de cultivo exento de suero para reducir los niveles de formas oxidadas de una gonadotropina dímera recombinante durante el proceso de su fabricación,

en que dicho medio de cultivo comprende un antioxi-dante seleccionado del grupo que consiste en:

- L-glutatión en una concentración que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/l;

- 2-mercaptoetanol en una concentración que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg/l;

- L-metionina en una concentración que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 mg/l; y

- una combinación de ácido ascórbico en una concentración que varía de aproximadamente 10 a aproxima-damente 50 mg/l y (+)-alfa-tocoferol en una concentración que varía de aproximadamente 5 a aproxima-damente 25 mg/l.

Medio de cultivo exento de suero para la producción de gonadotropinas recombinantes.

CAMPO DEL INVENTO

El presente invento está en el campo de la fabricación de proteínas recombinantes. Más específicamente, se refiere al uso de un medio de cultivo exento de suero, que comprende un antioxidante para reducir el nivel de formas oxidadas de gonadotropinas dímeras recombinantes durante el proceso de su fabricación. El antioxidante puede ser seleccionado del grupo que consiste en L-glutatión, 2-mercaptoetanol, L-metionina y una combinación de ácido ascórbico y (+) -alfa-tocoferol.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

EL presente invento se refiere a la producción de una hormona estimulante del folículo (FSH; del inglés, folliclestimulating hormone) recombinante. La FSH pertenece a la clase de las gonadotropinas.

La FSH se usa en el tratamiento de la infertilidad y de trastornos de la reproducción tanto en pacientes femeninos como masculinos. La FSH se usa en pacientes femeninos para inducción de la ovulación (OI; del inglés, ovulation induction) y para hiperestimulación ovárica controlada (COH; del inglés, controlled ovarian hyperstimulation) , por ejemplo, para tecnologías de reproducción asistida (ART; del inglés, assisted reproductive technologies) . En un régimen de tratamiento típico para inducción de la ovulación, se administran diariamente inyecciones de FSH o de un derivado de la misma (aproximadamente de 75 a 300 UI de rFSH/día) a un paciente durante un periodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 días. En un régimen de tratamiento típico para hiperestimulación ovárica controlada, se administran diariamente inyecciones de FSH o de un derivado de la misma (aproximadamente 150600 UI de rFSH/día) a un paciente durante un periodo de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 días. También se utiliza la FSH para inducir espermatogénesis en hombres que padecen oligospermia. Un régimen en que se utilizan 150 UI de FSH 3 veces a la semana en combinación con 2500 UI de hCG dos veces a la semana ha resultado exitoso en cuanto a conseguir una mejora del recuento de espermatozoides en hombres que padecen hipogonadismo hipogonadotrópico. A causa de la importancia de la FSH en el tratamiento de trastornos de la fertilidad, es deseable la provisión de una FSH de elevada estabilidad y elevada actividad específica.

En la naturaleza, la FSH es producida por la glándula pituitaria. Para uso farmacéutico, la FSH puede ser producida recombinantemente (rFSH) o puede ser aislada de la orina de hembras posmenopáusicas (uFSH) . El proceso de fabricación de rFSH requiere dos operaciones principales: el cultivo de una célula genéticamente modificada que exprese FSH, y la purificación de la proteína. La proteína es luego formulada con un vehículo farmacéuticamente aceptable con objeto de obtener una composición farmacéutica.

En el pasado, para el cultivo de células, el medio de cultivo solía estar complementado con suero, que servía como un nutriente universal para el crecimiento y el mantenimiento de todas las líneas celulares de mamífero. Sin embargo, el advenimiento de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE; del inglés, bovine spongiform encephalopathy) , una enfermedad neurodegenerativa transmisible del ganado vacuno con un largo período de latencia o incubación, ha provocado inquietudes sobre regulación relativas al uso de sueros de origen animal en la producción de productos biológicamente activos. Por lo tanto, actualmente se prefiere producir proteínas recombinantes usando medios exentos de suero. Dichos medios son bien conocidos en la técnica y son comercializados por diversas compañías, tales como, por ejemplo, Sigma, BioWhittaker, Gibco BRL, Cambrex y JRH.

Uno de los problemas encontrados cuando se almacena rFSH es la presencia de formas oxidadas de FSH. Para resolver parcialmente este problema, se puede añadir un antioxidante a la composición farmacéutica con objeto de estabilizar la proteína FSH durante el almacenamiento antes de su administración al paciente que necesita el tratamiento. Por ejemplo, en el Documento EP 0853945 (Skrabanja y Van den Oetelaar, 1998) se describen formulaciones líquidas que contienen gonadotropina mezcladas con un estabilizante, tal como, por ejemplo, citrato sódico en una concentración 25-100 mM y L-metionina en una concentración 1-10 mM. Se muestra que dichas formulaciones permiten el almacenamiento de formulaciones de FSH durante períodos más prolongados. El Documento WO 92/15614 (Takruri, H., 1992) también se refiere a un método para inhibir la oxidación de un polipéptido en una composición farmacéutica líquida o semilíquida, tal como, por ejemplo, un medio de almacenamiento o una disolución oftálmica acuosa. Específicamente, en el Documento WO 92/15614 se muestra que una disolución oftálmica o ungüento oftálmico que comprende L-metionina en una concentración de 10 mg/l estabiliza el factor de crecimiento epidérmico humano. Sin embargo, en los anteriores documentos sólo se describe el uso de un antioxidante en una formulación farmacéutica, y no en un medio de cultivo.

También se pueden añadir aminoácidos y compuestos que presentan actividad antioxidante a los medios de cultivo, sea como nutrientes o sea para proteger de la muerte celular a líneas celulares. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nº 4.560.655 se describe un medio exento de suero que comprende aproximadamente 30 mg/l de L-metionina, utilizándose dicho medio para el cultivo de células de testículo de cerdo, células de mieloma AG14 y células esplénicas murinas. En el Documento WO 95/12664 se enseña un método mediante el cual se puede superar, para una línea celular concreta, la desventaja debida a las cantidades insuficientes de diversos factores que limitan el crecimiento, siendo uno de ellos el aminoácido L-metionina. Específicamente, en el Documento WO 95/12664 se enseña un método para adaptar la línea celular CHO E5F3G, que expresa M-CSF humano, a crecer en una densidad celular aumentada. En este método, las células CHO E5F3G son hechas crecer en un medio que comprende 104 mg/l de L-metionina (véanse el Ejemplo y la Tabla 2) . Yun et al. enseñan que la adición de una combinación de glutatión y agentes quelantes de hierro al medio de cultivo reduce la muerte celular de células CHO (Yun et al., 2003) . Saito et al. enseñan además que se pueden usar diversos antioxidantes en medios de cultivo para proteger de la muerte celular a una línea celular (Saito et al., 2003) . Sin embargo, el Documento WO 95/12664, la Patente de EE.UU. nº 4.560.655, Yun et al. y Saito et al. no dicen nada sobre el posible efecto (si lo hubiera) de los aminoácidos, el glutatión y los agentes quelantes de hierro sobre el estado de oxidación de la proteína recombinante producida por la línea celular. En conclusión, en estos documentos sólo se describe el uso de L-metionina o de glutatión combinado con agentes quelantes de hierro para mejorar el crecimiento y/o la viabilidad de las células cultivadas.

El Documento WO 99/50390 se refiere a un medio de cultivo para producir interferón a partir de leucocitos, medio de cultivo que comprende metionina. Se demuestra por HPLC que la calidad de la proteína interferón después de la purificación resulta mejorada tras la adición de metionina al medio de cultivo. Los inventores del Documento WO 99/50390 proponen la hipótesis de que esta mejora puede ser debida a una oxidación disminuida de la proteína interferón . En el Documento WO 99/50390 se indica además que una cantidad demasiado pequeña de metionina da lugar a un efecto disminuido y que una cantidad demasiado grande causa menores producciones de interferón. Específicamente, en el Documento WO 99/50390 se enseña que un intervalo de aproximadamente 50 a 100 mg/l es un intervalo especialmente preferido cuando se produce interferón a partir de leucocitos. Además, en el Documento WO 99/50390 sólo se contempla un medio para la producción de interferón , que es una proteína monómera. En el Documento WO 99/50390 no se menciona ni sugiere un medio para la producción de hormonas dímeras, tal como, por ejemplo, FSH, que únicamente se secreta tras la dimerización (Matzuk et al., 1988) .

En resumen, ninguno de los documentos anteriormente mencionados se refiere al uso de un antioxidante en un medio de cultivo exento de suero para reducir la oxidación de gonadotropinas dímeras.

SUMARIO DEL INVENTO

El presente invento se basa en el inesperado hallazgo de que, ya durante la fabricación de rFSH, aparecen formas oxidadas de rFSH en... [Seguir leyendo]

1. Uso de un medio de cultivo exento de suero para reducir los niveles de formas oxidadas de una gonadotropina dímera recombinante durante el proceso de su fabricación, en que dicho medio de cultivo comprende un antioxidante seleccionado del grupo que consiste en:

- L-glutatión en una concentración que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/l;

- 2-mercaptoetanol en una concentración que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg/l;

- L-metionina en una concentración que varía de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 mg/l; y

- una combinación de ácido ascórbico en una concentración que varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/l y (+) -alfa-tocoferol en una concentración que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mg/l.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicho antioxidante es seleccionado del grupo que consiste en:

- L-glutatión en una concentración de aproximadamente 3 mg/l;

- 2-mercaptoetanol en una concentración de aproximadamente 10 mg/l;

- L-metionina en una concentración de aproximadamente 250 mg/l; y

- una combinación de ácido ascórbico en una concentración de aproximadamente 30 mg/l y (+) -alfatocoferol en una concentración de aproximadamente 14 mg/l.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en que dicho medio de cultivo es un medio químicamente definido.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que dicho medio de cultivo es seleccionado del grupo que consiste en SFM 90, SFM 90.1, SupMed300, DMEM, DMEM/F12, SFM CHO 3a, CHP PFM, Pro-CHO 5, EX-CELL, CHO-CD3, CHO III PFM, CHO-S-SFM II, CHO-DHFR, SFM4CHO, Ultra CHO, HyQ PF CHO, HyQ SFX CHO, HyQ CDM4CHO, IS CHO-CD, IS CHO-V y derivados de los mismos.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en que dicha gonadotropina dímera es la hormona estimulante del folículo (FSH) .

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que dicha gonadotropina dímera recombinante se produce en células de ovario de hámster chino (CHO) .