Un procedimiento de preparación de muestras para un medio sospechoso de contener contaminantes,

comprendiendo el procedimiento a) pasar un volumen conocido de dicho medio a través de un filtro desde un lado influente a un lado efluente, concentrando, de este modo, los contaminantes en el lado influente del filtro, b) poner en contacto el lado influente del filtro con un vehículo líquido que contiene al menos un sustrato que mediante la interacción con los contaminantes produce en cada caso un resto detectable y c) permitir interactuar al sustrato con los contaminantes en el lado influente del filtro durante un periodo que sea suficiente para permitir detectar en el vehículo líquido el resto detectable.

Medida de la contaminación

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la vigilancia y control ambiental, especialmente a la determinación de contaminantes en muestras ambientales. Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento senillo, versátil, sólido, fiable y rápido que proporciona una medición precisa de la contaminación (microbiana) , que se puede llevar a cabo in situ. La invención además proporciona un kit que es útil para realizar dichas mediciones.

Antecedentes de la invención

Para abordar el problema de la contaminación bacteriana se han desarrollado varias metodologías de pruebas. Los procedimientos clásicos se basan en el cultivo de las bacterias en un medio nutritivo que soporta el crecimiento. Tras aproximadamente 2-14 días, las bacterias capaces de crecer en medio sólido se han multiplicado hasta un nivel en el que las colonias se hacen visibles y se pueden contar, y las bacterias capaces de crecer en medio líquido se pueden medir mediante, por ejemplo, densidad óptica o peso seco. Se han realizado esfuerzos para acelerar y simplificar el proceso de detección. Entre estos esfuerzos hay procedimientos basados en las mediciones de radiometría, impedancia, quimioluminiscencia y fluorescencia.

Los enfoques radiométricos para identificar la contaminación bacteriana usan incorporación de un nutriente radiactivo por las bacterias. Las bacterias radiomarcadas se pueden aislar y cuantificar siguiendo el radiomarcaje. Esta metodología tiene varios inconvenientes indeseables. Aunque es muy sensible, usa radioisótopos, que pueden ser caros y difíciles de manipular.

Los procedimientos basados en la impedancia eléctrica normalmente incluyen una etapa de cultivo. A medida que los microorganismos crecen, se pueden detectar cambios en la impedancia del medio nutritivo y se correlacionan con el crecimiento microbiano. Los procedimientos basados en la impedancia eléctrica, aunque más rápidos que el cultivo clásico, todavía sin lentos e implican un periodo de incubación de 1-4 días.

El ATP se detecta mediante quimioluminiscencia. La detección y/o cuantificación de las bacterias mediante el uso de detección de ATP es rápida y se puede realizar en minutos. No obstante, el ATP es ubicuo y la cinética de la luminiscencia derivada del ATP es compleja, calidades que reducen la solidez de los procedimientos basados en este principio. Además, el retorno del ATP en las células es muy rápido y el contenido de ATP de las células puede experimentar enormes variaciones en un periodo corto de tiempo, por ejemplo cuando las células pasan de crecer a morir de hambre.

Se han descrito varios procedimientos en la técnica anterior basados en la degradación enzimática de un sustrato de unbeliferona marcado con fluorescencia, con monitorización concomitante de la fluorescencia derivada de la umbeliferona liberada. La detección o cuantificación de las bacterias mediante el uso de actividad enzimática también puede ser susceptible a interferencias por fuentes no bacterianas, aunque esta a interferencia parecer ser menos significativa. Además, la cantidad el producto (fluorescencia) formado por unidad de tiempo es lineal. La interferencia minimizada y la simple cinética hace que las mediciones de bacterias mediante el uso de actividad enzimática sean más sólidas.

El documento WO 03/012397 (Matsushita Seiko Co., Ltd, ) , que es un miembro de la familia del último documento publicado US 2004/0219628 (Tashiro et al.) , divulga un chip que recoge microorganismos en el que los microorganismos presentes en una muestra quedan atrapados y después se detectan por color, fluorescencia o luminiscencia. La cuantificación de los microorganismos se proporciona atrapando dichos microorganismos en un filtro, seguido de tinción. Como alternativa, la cuantificación de los microorganismos atrapados en el filtro de recolección se consigue mediante coloración diferencial de las diversas clases de microorganismos, tanto vivos como muertos, mediante la aplicación de diferentes compuestos colorantes. Además, las células viables se detectan mediante coloración usando compuestos que reaccionan con las enzimas presentes en las células microbianas para formar productos coloreados o fluorescentes. Varios ejemplos incluyen derivados de 4-metilumbeliferona.

La patente de EE.UU. nº 4, 591, 554 (Koumura et al.) divulga un procedimiento para detectar rápido microorganismos usando derivados de umbeliferona no fluorescentes, tales como 4-metil-umbeliferil-º-D-galactósido, 4-metil umbeliferil-a-D-galactósido, 4-metil-umbeliferil-fosfato y 4-metil umbeliferil-pirofosfato. La fluorescencia del resto umbeliferona liberado se induce a 360 nm y se monitoriza 450 nm. La potenciación de la sensibilidad se obtiene mediante una etapa de cultivo durante 1-12 horas.

La patente de EE.UU. nº 5, 518, 894 (Berg) divulga un procedimiento rápido para detectar la presencia de bacterias coliformes. Este procedimiento comprende una etapa de concentración (filtración) en combinación con una etapa de cultivo para aumentar el número de bacterias diana presentes. La fluorescencia del derivado de umbeliferona hidrolizado se monitoriza como indicación de la presencia de bacterias coliformes.

La patente de EE.UU. nº 5, 610, 029 (Ehrenfeld et al.) divulga un medio de cultivo para detectar la presencia o ausencia de microorganismos diana en una muestra. Este medio de cultivo incluye nutrientes y factores de crecimiento, así como un metabolito fluorescente (4-metil-umbeliferil-º-D-glucurónido) .

Todos los procedimientos mencionados anteriormente basados en la detección de la actividad enzimática fluorogénica usan una etapa de cultivo que normalmente conduce a un tiempo de rendimiento total de 6-72 horas, que, en muchos casos, no satisface las demandas de rendimiento de un procedimiento rápido, sin mencionar un procedimiento que se realice in situ.

La patente de EE.UU. nº 5, 089, 395 (Sny der et al.) divulga el uso de un derivado de umbeliferona no fluorescente que se convierte enzimáticamente en un producto fluorescente para detectar la presencia de bacterias. En este procedimiento no hay etapa de cultivo ni de concentración. Debido a la falta de estas etapas, el procedimiento no es muy sensible y requiere una concentración elevada de bacterias de al menos 1000/ml y, normalmente, una concentración mayor.

La patente de EE.UU. nº 5.968.762 (Jadamec et al.) divulga un procedimiento que usa un derivado de umbeliferona no fluorescente que se convierte enzimáticamente en un producto fluorescente para detectar la presencia de bacterias. La invención se refiere a medir la proporción entre la intensidad de la fluorescencia del producto fluorescente metabolizado a una longitud de onda específica y el conjugado fluorescente metabolizable a una segunda longitud de onda. Se da un tiempo de detección de aproximadamente 80 minutos para detectar una concentración de 310 (ufc/ml) (ufc= unidad formadora de colonias) .

La filtración en membrana de muestras líquidas se usa habitualmente para investigar muestras líquidas con bacterias. El filtro de membrana estéril se coloca en un dispositivo cerrado que se puede esterilizar y las bacterias se recogen en el filtro. Después, el filtro se puede colocar en un medio nutritivo que contiene agar en el que las colonias se pueden contar tras un procedimiento de cultivo. EL filtro también se puede tratar con un pigmento fluorogénico que se incorpora en las bacterias, que después se puede contar mediante fluorescencia inducida por láser. Todos los microbiólogos que usan filtración en membrana están familiarizados con los cuidados que hay que tomar para asegurar una manipulación estéril de los filtros. Al detectar pequeñas cantidades de bacterias, una etapa de filtración puede introducir fácilmente contaminaciones, lo que convierte al procedimiento en poco fiable y muy dependiente de las habilidades del técnico.

De acuerdo con lo anterior, en la técnica lo que se necesita es un procedimiento rápido para detectar la presencia de bacterias en una muestra que sea sencillo de realizar, sólido y fiable.

Objeto de la invención El objeto de la presente invención es abordar una serie de los inconvenientes y defectos mencionados anteriormente en la técnica anterior proporcionando un procedimiento rápido, fiable, versátil y sólido para determinar la presencia de microorganismos y otros contaminantes en una muestra.

Sumario de la invención

La presente invención se basa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de muestras para un medio sospechoso de contener contaminantes, comprendiendo el procedimiento a) pasar un volumen conocido de dicho medio a través de un filtro desde un lado influente a un lado efluente, concentrando, de este modo, los contaminantes en el lado influente del filtro, b) poner en contacto el lado influente del filtro con un vehículo líquido que contiene al menos un sustrato que mediante la interacción con los contaminantes produce cada uno un resto detectable y c) permitir interactuar al sustrato con los contaminantes en el lado influente del filtro durante un periodo que sea suficiente para permitir detectar en el vehículo líquido el resto detectable.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que, antes de la etapa a, el medio se pasa a través de un filtro previo que no retiene los contaminantes, pero retiene partículas más gruesas.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, seleccionándose los contaminantes del grupo que consiste en bacterias; hongos tales como hongos filamentosos y levaduras, algas, protozoos, esporas de bacterias, esporas de hongos y polen, y fragmentos de los mismos.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio es un medio líquido.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el medio líquido se selecciona del grupo que consiste en agua ambiental, agua potable, agua caliente, agua industrial, agua de proceso, agua de limpieza in situ, en extracto líquido de un material sólido, una muestra de superficie suspendida o solubilizada y productos industriales líquidos tales como cosméticos, productos farmacéuticos y productos alimentarios.

6. El procedimiento según la reivindicación 4-5, en el que la viscosidad del medio líquido se reduce antes de la etapa

a.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que la viscosidad se reduce mediante dilución o mediante tratamiento con un agente químico, tal como un agente adyuvante de la solubilidad o un detergente.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el medio es un medio gaseoso.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el medio gaseoso es aire, tal como aire procedente de una instalación estéril, de un dispositivo de flujo de aire laminar o aire ambiental.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el filtro tiene un tamaño de poro lo suficientemente pequeño como para retener sustancialmente todos los contaminantes presentes en el medio.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el filtro tiene un tamaño de poro lo suficientemente grande como para permitir que el resto detectable pase a través del filtro.

12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que el tamaño de poro es como máximo de 20 μm.

13. El procedimiento según la reivindicación 11 ó 12, en el que el tamaño de poro es al menos de 0, 1 μm.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un sustrato produce el resto detectable, siendo escindido mediante una enzima que es característica para los contaminantes.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que la enzima está seleccionada del grupo que consiste en carbohidrasas, proteasas, lipasas, esterasas, amidasas, sulfatasas, nucleasas y fosfatasas tales como fosfatasa alcalina.

16. El procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que la enzima es expresada constitutivamente por microorganismos.

17. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que al menos un sustrato es un sustrato fluorógeno o cromógeno que produce productos fluorescentes azules, verdes y rojos como resto detectable.

18. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en el que al menos un sustrato se selecciona del grupo que consiste en sal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato de disodio; sa.

9. (1, 3-dicloro-9, 9dimetilacridina-2-ona-7-il) -fosfato de amonio; sal fluoresceina-difosfato de tetraamonio; un derivado demetilumbeliferilo, tal como fosfato de 6, 8-difluoro-4-metilumbeliferilo, sal trihidrato de 4-metilumbeliferil-fosfato de diciclohexilamonio, ácido libre de fosfato de 4-metilumbeliferilo; sal 4-metilumbeliferilfosfato de dilitio, 4metilumbeliferil-º-N-acetilglucosamida y fosfato de troflurometilumbeliferilo, sales de fosfato de 4-nitrofenilo y fosfato de resorufina.

19. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en el que el resto detectable es detectable en una cantidad de como máximo 100 picomoles, preferentemente como máximo de 50 picomoles, más preferentemente como máximo de 20 picomoles e incluso más preferentemente como máximo de 10 picomoles y del modo más preferente de como máximo 1 picomol.

20. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones preferentes, en el que se usan al menos dos sustratos que producen restos detectables que proporcionan señales que pueden combinarse en un valor único de señal medida.

21. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que se usan al menos dos sustratos que producen restos detectables que proporcionan señales distinguibles.

22. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los contaminantes son microorganismos viables.

23. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cantidad de sustrato en el vehículo líquido no limita la velocidad de producción del resto detectable.

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la velocidad de producción del resto detectable es una función de la cantidad de contaminantes en el volumen conocido del medio.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que la función es linear.

26. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que varios volúmenes conocidos diferentes del medio se pasan cada uno a través de un filtro en la etapa a, para asegurar que al menos uno de los volúmenes contiene un número adecuado de contaminantes.

27. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el filtro es parte de un dispositivo de filtro estéril cerrado.

28. El procedimiento según la reivindicación 27, en el que el dispositivo de filtro estéril cerrado es desechable.

29. El procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, en el que el dispositivo de filtro estéril cerrado integra al filtro y a una carcasa de filtro en una unidad estructural cerrada irreversible.

30. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicacione.

2. 29, en el que el eje transversal más largo del dispositivo de filtro estéril cerrado no excede los 10 cm de longitud.

31. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la interacción de la etapa c se concluye interrumpiendo el contacto entre el sustrato y los contaminantes.

32. El procedimiento según la reivindicación 31, en el que la interrupción se logra evacuando el vehículo líquido desde el dispositivo de filtro mientras se retienen los contaminantes en el dispositivo de filtro.

33. El procedimiento según la reivindicación 32, en el que el vehículo líquido se evacua desde el dispositivo de filtro en la dirección que va desde el lado influente al efluente del filtro.

34. El procedimiento según la reivindicación 33, en el que la evacuación se logra aplicando una presión elevada sobre el lado influente del filtro o aplicando una presión reducida sobre el lado efluente del filtro.

35. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-30, en el que la interacción de la etapa c se concluye sobre el filtro o en el que la interacción no se concluye.

36. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende, después de la etapa c, una etapa d) posterior que implica detectar, cuantitativa o cualitativamente, el resto detectable en el vehículo líquido y correlacionar la detección del resto con la cantidad o presencia de contaminantes en la muestra.

37. El procedimiento según la reivindicación 36, en el que la detección de la etapa d se realiza midiendo la característica de fluorescencia del resto detectable.

38. El procedimiento según la reivindicación 37, en el que la fluorescencia se mide en la etapa d directamente sobre el vehículo líquido sin una interrupción del contacto entre el vehículo líquido y los contaminantes.

39. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicacione.

3. 38, en el que la correlación de la etapa d comprende el uso de una curva estándar predeterminada que expresa la relación entre la cantidad de contaminantes y la cantidad de resto detectable en condiciones estándar.

40. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicacione.

3. 39, en el que la detección se realiza en un sistema de microvaloración.

41. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los contaminantes se someten a una influencia potenciadora de la señal, bien antes de la etapa a o bien en la etapa b.

42. El procedimiento según la reivindicación 41, en el que la influencia potenciadora de la señal aumenta la sensitividad total en una detección subsiguiente o favorece la detección subsiguiente de tipos específicos de contaminantes, o reduce la detección de tipos específicos de contaminantes.

43. El procedimiento según la reivindicación 41, en el que la influencia potenciadota de la señal está seleccionada de una sustancia potenciadora enzimática, una temperatura selectiva o un intervalo de temperatura selectivo, un pH selectivo, una concentración de sal selectiva, un potenciador del crecimiento no selectivo y una sustancia potenciadora del crecimiento selectiva.

44. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa a está precedida por una incubación del medio.

45. El procedimiento según la reivindicación 44, en el que la incubación implica

- el tratamiento con una sustancia inductora de enzimas potenciando, por lo tanto, la detección del resto detectable y/o

- someter al medio a una sustancia selectiva para levadura, hongos o bacterias y/o

- someter al medio a un potenciador de crecimiento no selectivo para microorganismos y/o

- someter al medio a una sustancia capaz de extraer enzimas celulares.

46. Un kit para determinar contaminantes en un medio, comprendiendo el kit

- al menos un dispositivo de filtro estéril que comprende un filtro con un tamaño de poro lo suficientemente pequeño como para retener los contaminantes en el lado influente del filtro,

- medios para hacer pasar un volumen conocido de medio a través del filtro,

- al menos un agente que, después de la interacción con los contaminantes, liberará un resto detectable, cuya cantidad puede correlacionarse con la cantidad de contaminantes que han interactuado con el agente, e

- instrucciones que establezcan las etapas para a) obtener un volumen conocido y hacerlo pasar a través del dispositivo de filtro estéril, b) poner en contacto el lado influente del filtro en el dispositivo de filtro con el agente, c) permitir que el agente interactúe con contaminantes que puedan estar en el lado influente del filtro y d) detectar cuantitativamente el resto detectable.

47. Uso de un dispositivo de filtro estéril cerrado tal como un recipiente de reacción para una reacción entre contaminantes retenidos en el dispositivo y un sustrato que libera un resto detectable cuando se pone en contacto con los contaminantes.