Procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica bajo empleo de una dehidrogenasa de Azoarcus sp. EbN1.

Procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica de la fórmula Ia o Ib

Fórmula Ia Fórmula Ib

donde R1,

R2 representan grupos alquilo, alquenilo, arilo o alquilarilo, que pueden estar substituidos a su vez una o varias veces por alquilo, halógeno, SH, SR2, OH, OR2, NO2, CN, CO, COOR2, NR2R3 o NR2R3R+X, representando R2, R3 y R4, independientemente entre sí, H o un resto alquilo inferior o alcoxi inferior con 1 a 6 átomos de carbono, y representando X' un contraión, con la medida de que R1 sea diferente a R2, mediante reducción de la correspondiente cetona, llevándose a cabo la reducción con una deshidrogenasa con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO: 2, o con una secuencia de polipéptidos, en la que hasta un 25 % de restos aminoácido frente a SEQ ID NO: 2 se han modificado mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de los mismos.

Procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica bajo empleo de una dehidrogenasa de Azoarcus sp. EbN1

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica de la fórmula Ia o Ib

Fórmula Ia Fórmula Ib

Estado de la técnica La función de dehidrogenasas como biocatalizadores es conocida generalmente [Chemico-Biological Interactions (2003) 143:247, Journal of Biological Chemistr y (2002) 277:25677]. En especial se documenta la aplicación técnica de esta clase de enzimas para la obtención de productos químicos finos [Tetrahedron (2004) 60:633, Trends Biotechnol (1999) 17:487]. Según substrato, las deshidrogenasas conocidas se diferencian en su actividad y especificidad. Respecto a su estereoselectividad se diferencian en los denominados enzimas "Prelog" y "anti-Prelog" (Pure and Applied Chemistr y , (1964) , 9 : 119) . De este modo, para la obtención de derivados de feniletanol con actividad óptica se describen particularmente aquellos biocatalizadores que presentan selectividad "Prelog". Enzimas que presentan la enantioselectividad de sentido opuesto son poco frecuentes, aunque no son desconocidos [Trends Biotechnol (1999) 17:487, J. Org. Chem. (1992) 57:1532].

La WO 2005/108590 describe un procedimiento para la obtención de alcanoles con actividad óptica a partir de los correspondientes alcanoles mediante reducción enzimática, regenerándose de nuevo los equivalentes de reducción consumidos en el transcurso de la reacción mediante transformación de un alcohol sacrificial en la cetona sacrificial.

La WO 2006/094945 describe un procedimiento para la obtención de alcanoles con actividad óptica de estructura especial mediante reducción de las correspondientes cetonas por medio de una deshidrogenasa a partir de un organismo de la especie Azoarcus.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica de la 25 fórmula Ia o Ib

Fórmula Ia Fórmula Ib

donde R1, R2 representan grupos alquilo, alquenilo, arilo o alquilarilo, que pueden estar substituidos a su vez una o varias veces por alquilo, halógeno, SH, SR2, OH, OR2, NO2, CN, CO, COOR2, NR2R3 o NR2R3R+X, representando R2, R3 y R4, independientemente entre sí, H o un resto alquilo inferior o alcoxi inferior, y representando X' un contraión, con la medida de que R1 sea diferente a R2, mediante reducción de la correspondiente cetona, llevándose a cabo la reducción con una deshidrogenasa con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO: 2, o con una secuencia de polipéptidos, en la que hasta un 25 % de restos aminoácido frente a SEQ ID NO: 2 se han modificado mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de los mismos.

Una forma especialmente conveniente de ejecución de la invención consiste en un procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica de la fórmula Ia o Ib, donde R1 representa alquilo con 1 a 10 átomos de carbono y R2 representa fenilo, estando monosubstituidos los restos R1 y/o R2, en caso dado por halógeno.

La presente invención se refiere en especial a un procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica de la fórmula Ia, siendo válido para R1 que este resto ocupa menos espacio que R2.

Fórmula Ia Si el resto R2 ocupa mas espacio que R1, el alcohol según Prelog, V., Pure and Applied Chemistr y (1964) , 9, 119130, se clasifica en la categoría "anti-Prelog".

Alcoholes quirales se pueden diferenciar en los denominados enantiómeros "Prelog" y "Anti-Prelog". La asignación a una o ambas categorías se efectúa según el tamaño (demanda de espacio) de ambos grupos, que son adyacentes al grupo alcohol, y la orientación de la función hidroxi en relación a ambos grupos. Alcoholes con actividad óptica con configuración "anti-Prelog" son importantes precursores para diferentes productos activos.

Conceptos y definiciones generales Si no se da ningún otro dato son válidos los siguientes significados generales:

"halógeno" representa flúor, cloro, bromo o yodo, en especial flúor o cloro, "alquilo inferior" representa restos alquilo de cadena lineal o ramificados con 1 a 6 átomos de carbono, como metilo, etilo, i-o n-propilo, n-, i-, sec-o terc-butilo, n-pentilo o 2-metil-butilo, n-hexilo, 2-metil-pentilo, 3-metil-pentilo, 2-etilbutilo, "alquenilo inferior" representa los análogos mono-o poliinsaturados, preferentemente mono-o diinsaturados, de restos alquilo con 2 a 6 átomos de carbono citados anteriormente, pudiéndose situar el doble enlace en cualquier posición de la cadena de carbono.

"Alcoxi inferior" representa los análogos terminados en oxígeno de restos alquilo anteriores.

"Arilo" representa un resto aromático mono-o polinuclear, preferentemente mono-o dinuclear, en caso dado substituido, en especial fenilo, o un naftilo enlazado a través de cualquier posición de anillo, como 1-o 2-naftilo. Estos restos arilo pueden portar, en caso dado, 1 o 2 substituyentes iguales o diferentes, a modo de ejemplo halógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, según la anterior definición, o trifluormetilo.

"Enantioselectividad" en el ámbito de la presente invención significa que el exceso enantiomérico ee (en %) de uno de ambos enantiómeros posibles asciende al menos a un 50 %, preferentemente al menos un 80 %, en especial al menos un 90 %, y especialmente al menos un 95 %. El valor ee se calcula según:

ee (%) = enantiómero A -enantiómero B / (enantiómero A + enantiómero B) x 100

Formas de ejecución bioquímicas Las deshidrogenasas descritas (EC 1.1.X.X) son deshidrogenasas dependientes de NAD, o bien NADP (E.C.1.1.1.x) , en especial deshidrogenasas alcohólicas (E.C.1.1.1.1 o E.C.1.1.1.2) , que provocan la reducción selectiva de la cetona para dar el alcohol "anti-Prelog". La deshidrogenasa se obtiene a partir de un microorganismo, especialmente a partir de una bacteria, un hongo, en especial una levadura, depositada respectivamente en colecciones de cepas, u obtenible a partir de aislados de fuentes naturales, como muestras de suelo, muestras de biomasa y similares, o mediante la síntesis de novo-Gen.

La deshidrogenasa se puede emplear en forma purificada o parcialmente purificada, o en forma del microorganismo original, o de un organismo huésped recombinante, que exprime la deshidrogenasa. Los procedimientos para la obtención y purificación de deshidrogenasas a partir de microorganismos son suficientemente conocidos por el especialista, por ejemplo por K. Nakamura & T. Matsuda, "Reduction of Ketones" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim. Son igualmente conocidos procedimientos recombinantes para la generación de deshidrogenasas, a modo de ejemplo por W. Hummel, K. Abokitse, K. Drauz, C. Rollmann y H. Gröger, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, nº 1 + 2, páginas 153-159.

Bacterias apropiadas son, a modo de ejemplo, aquellas de las especies de Burkholderiales, Hydrogenophilales, Methylophilales, Neisseriales, Nitrosomonadales, Procabacteriales o Rhodocyclales.

Se describen especialmente deshidrogenasas de la familia de Rhodocyclaceae.

Se describen deshidrogenasas de las especies Azoarcus Azonexus, Azospira, Azovibrio, Dechloromonas, Ferribacterium, Petrobacter, Propionivibrio, Quadricoccus, Rhodocyclus, Sterolibacterium, Thauera y Zoogloea.

Se describen deshidrogenasas de tipos de especies Azoarcus.

La reducción con la deshidrogenasa se efectúa habitualmente en presencia de un cofactor apropiado (también denominado co-substrato) . Como cofactor para la reducción de la cetona sirve habitualmente NADH y/o NADPH. Además se pueden emplear deshidrogenasas como sistemas celulares, que contienen co-factor inherente, o mediadores redox alternativos (A. Schmidt, F. Hollmann y B. Bühler "Oxidation of Alcoholes" en K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, vol. III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim) .

La reducción con la deshidrogenasa se efectúa habitualmente en presencia de un agente reductor apropiado, que regenera el cofactor oxidado en el transcurso de la reducción. Son ejemplos de agentes reductores apropiados azúcares, en especial las hexosas, como glucosa, manosa, fructosa, y/o alcoholes oxidables, en especial etanol, propanol, butanol, pentanol o isopropanol, así como formiato, fosfito, o hidrógeno molecular. Para... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de alcoholes con actividad óptica de la fórmula Ia o Ib

Fórmula Ia Fórmula Ib

donde R1, R2 representan grupos alquilo, alquenilo, arilo o alquilarilo, que pueden estar substituidos a su vez una o varias veces por alquilo, halógeno, SH, SR2, OH, OR2, NO2, CN, CO, COOR2, NR2R3 o NR2R3R+X, representando R2, R3 y R4, independientemente entre sí, H o un resto alquilo inferior o alcoxi inferior con 1 a 6 átomos de carbono, y representando X' un contraión, con la medida de que R1 sea diferente a R2, mediante reducción de la correspondiente cetona, llevándose a cabo la reducción con una deshidrogenasa con la secuencia de polipéptidos SEQ ID NO: 2, o con una secuencia de polipéptidos, en la que hasta un 25 % de restos aminoácido frente a SEQ ID NO: 2 se han modificado mediante deleción, inserción, sustitución, o una combinación de los mismos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la dehidrogenasa se exprime mediante 15 recombinación en un organismo huésped, y la disolución de reacción se incuba con este organismo huésped.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el organismo huésped se ha exterminado previamente.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la reducción se lleva a cabo a una temperatura d.

2. 40º C.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el co-factor reducido se regenera a través del propio enzima, o porque como sistema regenerador de co-factor se emplea glucosa-dehidrogenasa, fosfitodehidrogenasa, formiato-dehidrogenasa, u otra alcohol-dehidrogenasa.