Implantes de tejido y método para la preparación y utilización de los mismos.

Método ex vivo de activación de las plaquetas, que comprende:

(a) proporcionar una muestra líquida que contiene plaquetas a una primera temperatura,

y

(b) añadir a la muestra una cantidad de sulfato de calcio exotérmico suficiente para activar las plaquetas.

Implantes de tejido y método para la preparación y utilización de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a la reparación de tejidos, y más concretamente a una matriz bioactiva, a métodos de preparación de dicha matriz, y a métodos de utilización de dicha matriz para estimular la formación de tejido duro.

Antecedentes de la invención

La formación de hueso es un proceso dinámico que se inicia durante la embriogénesis y continúa, mediante remodelado, durante la vida adulta. Ocasionalmente el hueso también puede regenerarse cuando se requiere la reparación ósea. Para la formación de hueso se requiere una compleja serie de sucesos, incluyendo el crecimiento y diferenciación celulares conjuntamente con la formación de matriz extracelular. Tiene lugar una secuencia similar de sucesos durante la reparación ósea.

El proceso de reparación y regeneración óseas es similar al proceso de cicatrización de heridas en otros tejidos. En general, en respuesta a una lesión, las células mesenquimales del tejido circundante migran hacia el sitio de la herida y se diferencian en cartílago o células óseas. Una secuencia típica de sucesos incluye: hemorragia, formación de coágulo, disolución del coágulo con eliminación concurrente de tejidos dañados, crecimiento de tejido de granulación, formación de cartílago, crecimiento capilar y renovación del cartílago, formación ósea rápida (tejido calloso) y, finalmente, remodelado del callo en hueso cortical y trabecular. Por lo tanto, la reparación ósea es un proceso complejo en el que participan muchos tipos celulares y moléculas reguladoras. Entre las diversas poblaciones celulares implicadas en la reparación de fracturas se incluyen células madre, macrófagos, fibroblastos, células vasculares, osteoblastos, condroblastos y osteoclastos.

También participan muchos factores de crecimiento en el proceso de regeneración. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, miembros de la familia de la proteína morfogénica ósea (BMP) , el factor de crecimiento fibroblástico (FGF) , el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y miembros de la familia del factor de crecimiento insulínico (IGF) . El PDGF, por ejemplo, se ha demostrado que estimula la replicación de las células óseas y la síntesis de ADN tanto en hueso calvaria intacto y en osteoblastos de rata aislados. Entre otros factores de crecimiento u hormonas que se ha informado que presentan la capacidad de estimular la formación de hueso nuevo se incluyen el factor de crecimiento fibroblástico ácido, estrógenos, factor estimulante de las colonias de macrófagos y agentes reguladores del calcio, tales como la hormona paratiroidea (PTH) .

Entre otros factores reguladores que es conocido que participan en la reparación ósea se incluyen hormonas sistémicas, citoquinas, factores de crecimiento y otras moléculas que regulan el crecimiento y la diferenciación. Se han purificado diversos agentes osteoinductores que se ha demostrado que son moléculas de tipo polipéptido factor de crecimiento. Puede encontrarse una fuente abundante de factores de crecimiento osteogénico en plasma rico en plaquetas. Las plaquetas presentan gránulos que contienen factores de crecimiento tales como PDGF, TGF-β y otros, que ayudan a acelerar la angiogénesis y la osteogénesis.

Las técnicas de reconstrucción ósea, tales como las utilizadas para reconstruir defectos que se producen como resultado de un traumatismo, cirugía del cáncer o errores del desarrollo, resultarían mejoradas por nuevos métodos de estimulación de la reparación ósea. Los métodos reconstructivos utilizados actualmente, tales como la utilización de injertos óseos autólogos o injertos óseos con tejido blando y vasos sanguíneos unidos, se asocian a desventajas significativas de tanto coste como dificultad. Por ejemplo, no resulta fácil recolectar una cantidad útil de hueso autólogo, e incluso los injertos autólogos con frecuencia se infectan o sufren de resorción.

Los métodos anteriores de inducción del crecimiento óseo han utilizado implantes sintéticos, o matrices, para proporcionar un soporte al crecimiento óseo utilizando materiales tales como el colágeno. Durante el diseño de una matriz bioactiva debe darse particular consideración a las características siguientes: biocompatibilidad, andamiaje (la capacidad de una matriz de permitir la migración y proliferación de células específicas de tejido) , rellenado (la capacidad de rellenado y por lo tanto la conservación de la forma original del sitio de regeneración) , efecto barrera (la capacidad de excluir células no relacionadas procedentes de la repoblación del sitio de regeneración) y función portadora (la capacidad del injerto artificial de portar y transportar factores bioactivos) . Sin embargo, una de las limitaciones más importantes en el diseño de una matriz bioactiva sigue siendo la incapacidad de determinar qué factores de crecimiento y moléculas de adhesión celular finalmente favorecen y controlan la histogénesis.

Varios grupos han investigado la posibilidad de utilizar proteínas y polipéptidos estimulantes óseos para influir sobre la reparación ósea in vivo. Sin embargo, existen muchas desventajas asociadas a este tipo de protocolos de tratamiento, incluyendo el tiempo y coste de purificar las proteínas recombinantes. Además, tras su administración en un animal, los polipéptidos pueden ser más inestables de lo deseado generalmente para un agente terapéutico, y pueden ser susceptibles de ataque proteolítico. Además, la administración de proteínas recombinantes pueden iniciar diversas respuestas inmunológicas de inhibición o de otro modo perjudiciales. Algunas limitaciones adicionales con frecuencia se relacionan con la incapacidad del portador de llevar niveles significativos del agente activo al sitio de crecimiento deseado. Por ejemplo, se han sometido a ensayo muchos materiales para la liberación sostenida de PDGF. El poli-L-láctido (PLLA) , aunque se utiliza comúnmente, aparentemente resulta reabsorbido con excesiva rapidez. Se han propuesto modificaciones del PLLA como ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) con una tasa de resorción mejorada y prolongada. Sin embargo, en ambos casos la unión celular puede ser limitada. Además, estos polihidroxiácidos pueden generar productos secundarios de degradación ácida en los sitios de implantación con una reacción no deseable del tejido. Recientemente se han propuesto otras modificaciones, tales como la combinación de PLLA con quitosano (un compuesto sintético estructuralmente similar al glucosaminoglicano de la matriz extracelular) para limitar la reacción del tejido debida al compuesto ácido y para mejorar la unión celular. Además, se han utilizado discos de colágeno o gel de metilcelulosa para administrar el PDGF, con resultados limitados debido a la rápida tasa de resorción. La característica aniónica de los cristales de hidroxiapatito se ha utilizado recientemente para transportar moléculas bioactivas catiónicas tales como el PDGF. El tejido óseo regenerado en este caso resulta cualitativamente alterado por la presencia de hidroxiapatito sintético, un compuesto no reabsorbible. En cada uno de estos casos, falta esencialmente alguna de las propiedades requeridas de una matriz biológica. En algunos casos se sacrifica el andamiaje para favorecer la liberación, mientras que en otros casos se sacrifica el rellenado de tejido en favor del andamiaje.

Además de la terapia de factor de crecimiento, los métodos anteriores de inducción del crecimiento óseo han contemplado la utilización de la terapia génica. Sin embargo, en la actualidad existen algunas limitaciones al transporte de ADN plasmídico en tejidos diferentes del hepático y el muscular. Los esfuerzos iniciales de la terapia génica somática se han basado en medios indirectos de introducir genes en los tejidos, denominados terapia génica ex vivo, por ejemplo se extraen células diana del cuerpo, se transfectan o se infectan con vectores que portan genes recombinantes y se reimplantan en el cuerpo ("transferencia de células autólogas") . En la actualidad se dispone de una diversidad de técnicas de transfección que pueden utilizarse para transferir ADN al interior de las células in vitro, entre ellas la precipitación de ADN con fosfato de calcio, la transfección con DEAE-dextrano, la electroporación, la transferencia de ADN mediada por liposomas o la transducción con vectores víricos recombinantes. Se han propuestos dichos protocolos de tratamiento ex vivo para transferir ADN a... [Seguir leyendo]

1. Método ex vivo de activación de las plaquetas, que comprende:

(a) proporcionar una muestra líquida que contiene plaquetas a una primera temperatura, y

(b) añadir a la muestra una cantidad de sulfato de calcio exotérmico suficiente para activar las plaquetas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra comprende plasma rico en plaquetas.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra se encuentra sustancialmente libre de actividad de trombina.

4. Método según la reivindicación 1, en el que las plaquetas no han sido activadas por trombina.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la primera temperatura es una temperatura ambiente.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la sal incrementa la temperatura del líquido hasta una temperatura comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 50ºC.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la sal incrementa la temperatura del líquido hasta una temperatura comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 40ºC y aproximadamente 45ºC.

8. Método según la reivindicación 1, en el que las plaquetas liberan un factor de crecimiento tras la activación.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el factor de crecimiento es factor de crecimiento derivado de plaquetas.

10. Matriz bioactiva que comprende plaquetas activadas con sulfato de calcio cristalino y sulfato de calcio exotérmico, para la utilización en un método de estimulación de la formación de hueso en un sitio preseleccionado en un mamífero, comprendiendo el método:

proporcionar en el sitio la matriz bioactiva, en el que la matriz bioactiva estimula la formación de hueso en el sitio.

11. Matriz según la reivindicación 10, en la que el sitio es un defecto óseo.

12. Matriz según la reivindicación 11, en la que el defecto óseo es una cavidad o una fractura.

13. Matriz según la reivindicación 12, en la que la fractura es una fractura no consolidada.

14. Matriz según la reivindicación 10, en la que la matriz bioactiva comprende además un factor de crecimiento.

15. Matriz según la reivindicación 14, en la que el factor de crecimiento es factor de crecimiento derivado de plaquetas.

16. Matriz según la reivindicación 10, en la que la matriz bioactiva comprende además un ácido nucleico.

17. Matriz según la reivindicación 10, en la que el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un gen preseleccionado expresable en el sitio.

18. Matriz según la reivindicación 17, en la que el ácido nucleico es capaz de ser transfectado en una célula y expresarse en la misma en el sitio preseleccionado.

19. Matriz según la reivindicación 10, en la que la matriz bioactiva se dimensiona de manera que permita la infiltración, proliferación y diferenciación de las células en el sitio preseleccionado.

20. Matriz según la reivindicación 19, en la que las células son células óseas progenitoras.

21. Matriz según la reivindicación 20, en la que las células son células osteoblásticas.

22. Matriz según la reivindicación 10, en la que la matriz bioactiva se encuentra sustancialmente libre de actividad de trombina.

23. Matriz según la reivindicación 10, en la que las plaquetas activadas se disponen dentro de un plasma rico en plaquetas.

24. Matriz según la reivindicación 10, que comprende además la etapa de manipular la matriz bioactiva para producir una forma de interés en el sitio preseleccionado.

25. Matriz según la reivindicación 10, en la que las plaquetas activadas con sulfato de calcio exotérmico se producen mediante el método según la reivindicación 1.

26. Matriz bioactiva que comprende: una mezcla de plaquetas activadas con sulfato de calcio cristalino y con sulfato de calcio exotérmico.

27. Matriz según la reivindicación 26, en la que la matriz se encuentra sustancialmente libre de actividad de trombina.

28. Matriz según la reivindicación 26, que comprende además un factor de crecimiento.

29. Matriz según la reivindicación 28, en la que el factor de crecimiento es factor de crecimiento derivado de plaquetas.

30. Matriz según la reivindicación 26 ó 28, que comprende además un ácido nucleico.

31. Matriz según la reivindicación 30, en la que el ácido nucleico codifica un gen preseleccionado expresable en el sitio.

32. Matriz según la reivindicación 26, en la que la matriz bioactiva se dimensiona de manera que permita la infiltración, proliferación y diferenciación de las células en el sitio preseleccionado.

33. Matriz según la reivindicación 32, en la que las células son células óseas progenitoras.

34. Matriz según la reivindicación 33, en la que las células son células osteoblásticas.

35. Matriz bioactiva que comprende:

(i) un primer dominio que define una superficie externa y que comprende sulfato de calcio cristalino y plasma rico en plaquetas,

y que opcionalmente comprende además un primer factor de crecimiento, y

(ii) dispuesto sobre la superficie externa del primer dominio, un segundo dominio que comprende sulfato de calcio cristalino

y plasma rico en plaquetas, y que opcionalmente comprende además un segundo factor, diferente, de crecimiento, con la condición de que por lo menos uno de entre el primer dominio y el segundo dominio comprenda un factor de crecimiento, en el que el plasma rico en plaquetas del primer dominio y/o del segundo dominio comprende plaquetas activadas con sulfato de calcio exotérmico.

36. Matriz según la reivindicación 35, en la que el primer dominio se encuentra sustancialmente libre de actividad de trombina.

37. Matriz según la reivindicación 35 ó 36, en la que el segundo dominio se encuentra sustancialmente libre de actividad de trombina.

38. Matriz según la reivindicación 35, en la que el primer dominio se dimensiona de manera que permita la infiltración, proliferación y diferenciación de las células progenitoras.

39. Matriz según la reivindicación 35, en la que el segundo dominio se dimensiona de manera que permita la infiltración, proliferación y diferenciación de las células progenitoras.

40. Matriz según la reivindicación 35, en la que el primer dominio comprende un primer factor de crecimiento.

41. Matriz según la reivindicación 35 ó 40, en la que el segundo dominio comprende un segundo factor de crecimiento.

42. Matriz según la reivindicación 31, para la utilización en un método de expresión de un ácido nucleico de interés en un sitio preseleccionado en un mamífero, comprendiendo el método:

(a) introducir la matriz en el sitio preseleccionado en el mamífero, y

(b) permitir la expresión del ácido nucleico en el sitio preseleccionado.

43. Matriz según la reivindicación 42, en la que dicho ácido nucleico codifica un factor de crecimiento.

44. Matriz según la reivindicación 43, en la que el factor de crecimiento es factor de crecimiento osteogénico.

45. Matriz según la reivindicación 42, en la que dicho ácido nucleico codifica una proteína seleccionada de

entre el grupo que consiste de factor de crecimiento derivado de plaquetas y una proteína morfogénica 5 ósea.

46. Matriz según la reivindicación 45, en la que dicho ácido nucleico comprende además una secuencia de promotor.

47. Matriz según la reivindicación 42, en la que el sitio es un defecto óseo.

48. Matriz según la reivindicación 47, en la que el defecto óseo es una cavidad o una fractura.