DISPOSITIVO DE ENSAYO PARA UN DIAGNÓSTICO RÁPIDO.

[0001] Esta invención se refiere a métodos y dispositivos para detectar analitos o análogos de los mismos en una muestra biológica. Esta invención se refiere a ensayos rápidos mejorados tales como dispositivos de tipo tira reactiva. La invención se refiere en particular a un dispositivo de ensayo hecho de uno o más lados activos, para permitir detecciones individuales o múltiples, detecciones cuantitativas o semi-cuantitativas. Los dispositivos descritos en esta invención permiten detectar o identificar diversos productos biológicos o químicos con una manipulación. Antecedentes de la invención [0002] Se han desarrollado varias estrategias para la detección de analitos en una muestra biológica para diagnóstico rutinario en laboratorios de diagnóstico mediante, por ejemplo, inmunocromatografía. [0003] Los documentos EP 0 088 636, EP 0 186 799, EP 0 284 232 y WO 88/08534 describen dispositivos cromatográficos similares a una lámina que comprenden al menos una primera y una segunda zona o región. Los dispositivos de la técnica anterior descritos en estos documentos comprenden: - una primera región o zona que contiene material activo poroso para permitir que el líquido se mueva hasta la región sensibilizada recubierta con reactivos específicos. Esta primera zona o región comprende un reactivo de detección secado sobre ella o impregnado sobre ella. Puede contener además una (sub)zona de aplicación y/o una (sub)zona de absorción. Esta primera zona se denomina generalmente como la zona de aplicación; - una segunda región o zona, también denominada como la zona de detección, hecha de material activo poroso sobre el cual se adsorben reactivos específicos. Algunos de estos reactivos descansan sobre una subzona (por ejemplo una línea) de la segunda región del dispositivo son específicos para el analito a detectar y deben reaccionar con el complejo del analito en la muestra-reactivo de marcado mientras otros reactivos no específicos eventualmente descansan sobre una subzona adicional (por ejemplo como una línea adicional) de la segunda región están destinados a reaccionar con el exceso del reactivo de detección. Esta segunda zona o región, preferiblemente hecha de nitrocelulosa, también puede contener una subzona de control, preferiblemente detrás de la zona de detección; y - una tercera región o zona hecha de material poroso dedicada a absorber el exceso de líquido que llega a través de las primera y segunda regiones. Esta región se denomina generalmente como la región absorbente o de absorción. [0004] Los dispositivos (inmuno)cromatográficos de la técnica anterior pueden tener un soporte de refuerzo de plástico u otro y/o pueden estar comprendidos en una carcasa impermeable al agua. [0005] Las tres regiones están en contacto por capilaridad para permitir los movimientos de líquidos desde la zona de aplicación a la tercera región. [0006] El documento US 2002001818 describe un dispositivo de ensayo en seco que implica el uso de una tira de un material absorbente a través de la cual fluye la muestra de fluido corporal y en la que un primer analito se determina por calorimetría en una primera región de la tira y un segundo analito se determina mediante un inmunoensayo que tiene lugar en una segunda región de la tira que está situada aguas abajo de la primera región. [0007] El documento US 2004023412 describe un método para determinar un analito que usa una matriz de flujo que muestra: a) opcionalmente una zona de aplicación (AR*Z) para un reactivo de unión que es detectable de forma analítica; b) una zona de detección (DZ), que está situada aguas abajo de la ASZ y muestra un reactivo de unión adicional (Capturador) anclado firmemente a la matriz, y en el que un complejo que contiene el Capturador y el analito y/o Reactivo* se forma durante la reacción. [0008] El documento US 2005227371 describe dispositivos para realizar ensayos de etapa única, en los que dichos dispositivos comprenden un reactivo de unión a un analito marcado inmovilizado de forma reversible sobre un material sólido no poroso, material sólido que está en contacto físico con un portador poroso seco que porta un reactivo de unión a un analito inmovilizado. 2   [0009] El documento WO 9832019 describe un dispositivo para la detección autónoma de un analito, en el que el líquido de muestra es transportado a través de un conducto que comprende una zona de detección que está conectada de forma operativa a un elemento absorbedor. [0010] Aunque útiles, los dispositivos cromatográficos disponibles actualmente que usan tiras de ensayo tienen una serie de desventajas. Muchas muestras, tales como muestras fecales, contienen materia particulada que puede atascar los poros del medio cromatográfico, obstaculizando en gran medida el proceso inmunocromatográfico. Además, frecuentemente es difícil con los dispositivos de ensayo cromatográfico existentes aplicar la muestra al medio cromatográfico, de modo que el frente de la muestra se mueva uniformemente a través del medio cromatográfico para asegurar que la muestra alcanza el área en el que se producirá la unión de una manera uniforme, en línea recta. La preparación de la muestra y la generación de residuos son responsables de otros problemas con dispositivos y técnicas para inmunocromatografía disponibles actualmente. Raramente es posible aplicar una muestra (tal como heces) o un dispositivo de muestreo (tal como un hisopo para la garganta) directamente al medio cromatográfico. Varias reacciones de extracción y pre-tratamiento se requieren habitualmente antes de que la muestra pueda ser aplicada al medio cromatográfico. Estas reacciones son realizadas típicamente por el facultativo o técnico que realiza el ensayo en varios recipientes pequeños, tales como tubos de ensayo o tubos de microcentrífuga, que requieren el uso de dispositivos de transferencia tales como pipetas. Cada uno de estos dispositivos se contamina a continuación y deben disponerse precauciones de uso especiales, de modo que los trabajadores o personas que puedan entrar inadvertidamente en contacto con los residuos no resulten contaminados. [0011] Por lo tanto, sería deseable tener un dispositivo de ensayo cromatográfico capaz de recibir una muestra posiblemente contaminada o un dispositivo de preparación de muestras directamente para eliminar la necesidad de recipientes de extracción y dispositivos de transferencia. Dicho dispositivo, preferiblemente en forma de una tira de ensayo, también debe ser capaz de realizar ensayos sobre muestras que contienen particulados sin atasco o sin interferencia y debe ser capaz de suministrar la muestra al medio cromatográfico uniforme y equitativamente para mejorar la exactitud y la precisión del ensayo. Este aspecto de un dispositivo de ensayo mejorado es particularmente importante para evitar falsos negativos y falsos positivos. Objetivos de la invención [0012] La presente invención pretende proporcionar un método de detección de analitos como se define en la reivindicación adjunta 1 que usa dispositivos similares a una lámina altamente flexibles adecuados para la detección de múltiples analitos o análogos de los mismos en una solución o muestra biológica, realizándose estas detecciones en el mismo dispositivo. El dispositivo similar a una lámina está diseñado para permitir el movimiento de líquido por gravedad y capilaridad. En las reivindicaciones adjuntas 2 a 12 se definen realizaciones preferidas. Resumen de la invención [0013] La presente invención proporciona un método de detección de analitos como se define en la reivindicación 1 que usa un dispositivo de ensayo (que funciona por gravedad) hecho de uno o más lados activos, para permitir detecciones individuales o múltiples, detecciones cuantitativas o semicuantitativas, a través de un proceso que funciona por gravedad que permitirá que una muestra de líquido entre en contacto con las diferentes zonas reactivas del dispositivo. [0014] En particular, la presente invención proporciona un método de detección de analitos para la detección de al menos un analito en una muestra, que comprende las etapas de colocar verticalmente un dispositivo de ensayo, poner en contacto al dispositivo de ensayo con una muestra y permitir que la muestra se mueva desde la parte superior del dispositivo hasta la parte inferior del dispositivo, por gravedad a través de una zona sin capilares (14) del dispositivo, y detectar el analito, en el que el dispositivo de ensayo comprende: en uno o más lados de un soporte sólido (18), dispuestas desde un extremo del dispositivo al otro extremo del dispositivo: (a) una primera zona con capilares que comprende una zona de aplicación de la muestra (2), en la que la zona de aplicación de la muestra (2) comprende al menos un conjugado específico de analito con marca directa o indirecta para la detección del al... [Seguir leyendo]

1. Método de detección de analitos para la detección de al menos un analito en una muestra, que comprende las etapas de colocar verticalmente un dispositivo de ensayo, poner en contacto el dispositivo de ensayo con una muestra y permitir que la muestra se mueva desde la parte superior del dispositivo hasta la parte inferior del dispositivo, por gravedad a través de una zona sin capilaridad (14) del dispositivo y detectar el analito, en el que el dispositivo de ensayo comprende: en uno o más lados de un soporte sólido (18), dispuestas de un extremo a otro extremo del dispositivo: (a) una primera zona de capilaridad que comprende una zona de aplicación de la muestra (2), en la que la zona de aplicación de la muestra (2) comprende al menos un conjugado específico de analito con un marcador directo o indirecto para la detección del al menos un analito o análogo del mismo; (b) una segunda zona de capilaridad que comprende una zona de detección (4), opcionalmente una zona intermedia (6), dispuesta cerca de dicha zona de detección (4) y opcionalmente una zona o región absorbente (5) dispuesta cerca de dicha zona de detección (4), dicha zona de detección (4) comprendiendo opcionalmente una subzona de control; y en la que la zona de detección (4) comprende al menos un reactivo de captura que reconoce específicamente el al menos un analito o análogo del mismo; y (c) la zona sin capilaridad (14) separando la zona de aplicación de la muestra (2) de la primera zona de capilaridad de la zona de detección (4) o de la zona intermedia opcional (6) de la segunda zona de capilaridad, en el que dicha zona de aplicación de la muestra (2), dicha zona sin capilaridad (14) y dicha zona de detección (4) o dicha zona intermedia opcional (6) se disponen de tal manera que la muestra puede fluir solamente por gravedad desde la zona de aplicación de la muestra (2) hasta la zona de detección (4) o hasta la zona intermedia opcional (6). 2. Método de detección de analitos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende poner en contacto a una zona de recepción de la muestra en el dispositivo con una muestra, permitir que la muestra migre por capilaridad a través de la zona de recepción de la muestra a una zona sin capilaridad, permitir que la muestra migre a través de la zona sin capilaridad por gravedad hasta una zona de detección y permitir que la muestra migre a través de la zona de detección por capilaridad y detectar el analito. 3. El método de detección de analitos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de colocar verticalmente el dispositivo de ensayo, aplicar una muestra en la parte superior del dispositivo, permitir que la muestra migre a través de la zona de aplicación de la muestra (2) e hidrate el al menos un conjugado específico de analito, permitir que al menos un analito en dicha muestra reaccione con el al menos un conjugado específico de analito, formando de este modo al menos un complejo, permitir que el al menos un complejo alcance la zona sin capilaridad, para pasar por gravedad la zona sin capilaridad para entrar en contacto y migrar a través de la zona intermedia opcional (6) y pasar a través de la zona de detección (4) reaccionando de este modo con al menos un reactivo de captura y permitir el desarrollo de una señal detectable, detectando de este modo dicho al menos un analito. 4. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la detección de analitos o análogos de microorganismos (dañinos) que comprenden Cryptosporidium parvum, Toxoplasma gondii, Giardia lamblia, E. coli, E. histolytica, C. difficile, toxinas de C. difficile, VRS (Virus Respiratorio Sincitial), virus de la gripe A y B, rotavirus, adenovirus de tipos 40 y 41 u otros grupos de adenovirus, antígeno urinario de Legionella pneumophila, coronavirus de origen humano y animal y metapneumovirus humanos. 5. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos reactivos de captura se seleccionan del grupo que comprende oligonucleótidos o análogos de los mismos, anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos de anticuerpo hipervariables, o un antígeno reconocido por compuestos serológicos tales como IgG, IgA, IgE e IgM o uno de los reactivos específicos de pares como biotinaestreptavidina. 6. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la zona de aplicación de la muestra (2) comprende además al menos un conjugado de control. 7. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la zona de detección (4) comprende al menos una línea de ensayo de control con al menos un reactivo de captura de control (7) que reconoce específicamente al conjugado de control en la zona de aplicación (2). 8. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el conjugado específico del analito y/o el conjugado de control comprenden un marcador seleccionado del grupo que comprende, coloides metálicos conjugados, microesferas de poliestireno conjugadas, nanotubos y micro- o nanopartículas de carbono con un color particular, y micro- o nanopartículas fluorescentes. 21   9. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la zona de detección (4) comprende una membrana activa (16) hecha de nitrocelulosa u otra matriz capaz de quedar recubierta por reactivos que interactúan con otros reactivos situados en la zona de aplicación o presentes en la muestra a ensayar. 10. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la zona intermedia (6) comprende una membrana absorbente (15). 11. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que una pegatina (20) cubre la zona de aplicación de la muestra (2), la zona sin capilaridad (14), la zona intermedia (6) y se solapa parcialmente con la zona de detección (4). 12. El método de detección de analitos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho dispositivo está provisto en una cubierta hueca o una cubierta moldeada con calor o está incrustado en un polímero. 22   23   24     26   27   28   29     REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción 31