Ensayo de estabilidad de anticuerpos.

Un método para la detección de anticuerpos IgG y de fragmentos de anticuerpo IgG en una muestra,

caracterizado de manera que incluye los siguientes pasos in vitro:

a) proporcionar una muestra que contiene un anticuerpo IgG y/o fragmentos de anticuerpo IgG

b) incubar la muestra proporcionada según a) con

iv) la proteasa de cisteína IdeS específica para IgG,

v) N-glucosidasa F,

vi) el agente reductor tricloroetilfosfato y ácido fórmicodonde la incubación en los pasos b)-i), b)-ii) y b)-iii) es secuencial,

c) analizar la muestra incubada según b) mediante una cromatografía líquida acoplada a una espectrometría demasas para detectar el anticuerpo intacto y/o para detectar fragmentos del anticuerpo contenidos en la muestra quese proporciona según a).

Ensayo de estabilidad de anticuerpos.

Información de los antecedentes

En los últimos años, el campo de la industria farmacéutica ha tenido mucho éxito con los productos basados en, entre otros, enzimas, anticuerpos y citocinas tales como, por ejemplo la eritropoyetina, los interferones y los activadores del plasminógeno. La demanda mundial de agentes terapéuticos proteicos aumenta cada año. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs, anticuerpos monoclonales) son un grupo importante dentro de las proteínas terapéuticas. Se conocen como monoclonales debido a que, a diferencia de los anticuerpos policlonales, se secretan por células inmunológicas (clones celulares) que derivan de una única célula formadora de anticuerpos. Una característica de los anticuerpos monoclonales es que cada uno de ellos está dirigido únicamente contra un epítopo de una sustancia inmunogénica y, por tanto, únicamente contra un determinante antigénico y, por consiguiente, puede utilizarse específicamente en el tratamiento de enfermedades. Algunos ejemplos de proteínas terapéuticas son los anticuerpos monoclonales Trastuzumab (nombre comercial: Herceptin) , Daclizumab (nombre comercial: Zenapax) y Rituximab (nombre comercial: MabThera) de Roche Diagnostics GmbH Company, que se han utilizado satisfactoriamente en el tratamiento del cáncer de mama (Trastuzumab) , el rechazo de un órgano (Daclizumab) y para tratar el linfoma no Hodgkin (Rituximab) , entre otros.

Los anticuerpos monoclonales terapéuticos se obtienen mediante procesos biotecnológicos complejos. Se pueden formar productos de degradación durante su producción, formulación y almacenamiento, lo que a menudo lleva a procesos como las reacciones de oxidación y desamidación, así como a escisiones proteolíticas (Yan, B., et al., J. Chromatog. A 1164 (2007) 153-161) . Las modificaciones de los productos biológicos pueden dar como resultado un cambio en la actividad y/o inmunogenicidad debido a los cambio estructurales en la molécula, incluso cuando estos ocurren sólo en pequeña medida.

Además de su acción, la calidad de un producto biofarmacéutico es de una importancia decisiva. Consecuentemente, de manera adicional a la investigación detallada de los modos de acción, es absolutamente esencial determinar la identidad, pureza y actividad de un fármaco basado en proteínas, con tal de que se pueda utilizar de forma segura como agente terapéutico.

Aunque los mAb pueden analizarse satisfactoriamente mediante varias técnicas de separación y de ensayo, durante mucho tiempo ha sido difícil la aplicación y optimización de los métodos de RP-HPLC (RP-HPLC, cromatografía líquida de alto rendimiento de fase reversa) para separar las especies de anticuerpos. No obstante, durante el curso de un proceso de degradación se presentan simultáneamente varias modificaciones del anticuerpo, lo que hace más difícil el análisis de las diversas bandas cromatográficas y electroforéticas. El análisis mediante los métodos de separación por cromatografía líquida acoplados a los espectrómetros de masas de alta resolución (LC/MS, cromatografía líquida/espectrometría de masas) proporciona información sobre la masa exacta de varias especies y, por consiguiente, facilita la identificación de las variantes del anticuerpo (Dillon, T.M., et al., J. Chromatogr. A, 1053 (2004) 299-305) .

La endoproteasa de cisteína IdeS (enzima S que degrada la inmunoglobulina) del patógeno humano Streptococcus pyogenes, también conocida como Mac-1 o sib-38, es una proteasa de cisteína que escinde específicamente la cadena pesada de anticuerpos del tipo de inmunoglobulina G (IgG) . Hasta la fecha, la IgG es el único sustrato conocido de la IdeS (Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549) . La IdeS consiste en 339 aminoácidos que incluyen un péptido señal de 29 aminoácidos (von Pawel-Rammingen, U., et al., EMBO J. 21 (2002) 1607-1615) donde se forma un motivo RGD en los aminoácidos 214-216. La IdeS escinde la IgG humana (inmunoglobulina de clase G) entre los aminoácidos 236 y 237 (Gly-Gly) que se encuentran en la secuencia de reconocimiento LLGGP. La IgG2 humana se escinde entro los aminoácidos alanina y glicina en el motivo de reconocimiento PVAGP. Los anticuerpos murinos de los tipos IgG2a e IgG3 también se escinden (Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 1554015549) .

Hess, J.K., et al. (Hess, J.K., et al., J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291) describen un método de espectrometría de masas para la determinación de la actividad enzimática de IdeS con la ayuda de la espectrometría de masas SELDI-TOF. En la patente US 2007/0237784 se describe un polipéptido que se aisló en S. pyogenes y que presenta actividad proteasa de cisteína IgG. En la solicitud de patente europea EP 1 458 861 se describe un método para la formación de fragmentos Fc o Fab de anticuerpos. La proteasa IdeS del grupo A de los estreptococos se describe en la patente WO 2006/131347.

Shantha Raju, T. y Scallon, B.J. describen en Biochem. Biophys. Res. Commun. 341 (2006) 797-803 que la glicosilación del dominio Fc de la IgG aumenta la resistencia frente a la escisión con papaína. Beck, A. et al. (J. Chrom. B 819 (2005) 2303-218) describen la caracterización mediante la cromatografía líquida en combinación con la espectrometría de masas de anticuerpos monoclonales anti-receptor de IGF-1 producidos en las células CHO y NS0. Loo, T., et al. (Prot. Expr. Purif. 24 (2002) 90-98) describen la utilización de la secreción para solventar un problema de solubilidad: la expresión de alto rendimiento en Escherichia coli y la purificación de la glucoamidasa PNGasa F bacteriana.

Resumen de la invención

La presente invención describe un método para la detección de anticuerpos IgG y fragmentos de anticuerpo IgG o formas modificadas de un anticuerpo IgG en una muestra, caracterizado de tal manera que incluye los siguientes pasos:

donde la incubación en los pasos b) -i) , b) -ii) y b) -iii) es secuencial,

c) analizar la muestra incubada según b) mediante una cromatografía líquida acoplada a una espectrometría de masas para detectar el anticuerpo intacto y para detectar fragmentos o formas modificadas del anticuerpo contenidas en la solución que se proporciona según a) .

En una realización del método la proteasa de cisteína IdeS deriva de Streptococcus pyogenes o Treponema denticola. En una realización adicional la proteasa de cisteína específica para IgG tiene la secuencia de aminoácidos Id. de Sec. Nº:1. Otra realización incluye la incubación con una proteasa de cisteína específica para IgG en el intervalo de pH de 5, 5 a 8, 5. En otra realización el intervalo de pH es de entre 7, 0 y 8, 0 y, en una realización adicional, entre 7, 5 y 8, 0. Aún en otra realización adicional, la proporción molar entre la proteasa de cisteína específica para IgG y el anticuerpo y/o los fragmentos de anticuerpo contenidos en la muestra es de entre 1:25 y 1:2500, preferiblemente entre 1:25 y 1:100.

Otra realización se caracteriza porque la N-glucosidasa F deriva de Flavobacterium meningosepticum (EC 3.2.2.18, EC 3.5.1.52) . En otra realización, se trata de la glucosidasa Endo H y se utiliza a un pH entre 6, 0 y 6, 5. En otra realización, la glucosidasa tiene la secuencia de aminoácidos Id. de Sec. Nº:2. Otra realización es en la que se añade el agente reductor simultáneamente con el ácido fórmico y la incubación se lleva a cabo en presencia de ambos agentes. Una realización adicional es aquella en la que la incubación con el agente de reducción se lleva a cabo a una temperatura de 60°C o más. En una realización adicional, la espectrometría de masas es una espectrometría de masas de tiempo de vuelo con ionización por electropulverización (ESI-TOF) . Aún en una realización adicional, la cromatografía líquida es una cromatografía de interacción hidrofóbica o una cromatografía de interacción I-I .En el caso de una cromatografía de interacción hidrofóbica, el ligando de la cromatografía en otra realización es un ligando C8 o C18 unido a un material de cromatografía que tiene un tamaño de poro de 300 ángstroms, o en el caso de la cromatografía de interacción I-I el ligando de la cromatografía es un ligando difenilo.... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de anticuerpos IgG y de fragmentos de anticuerpo IgG en una muestra, caracterizado de manera que incluye los siguientes pasos in vitro:

donde la incubación en los pasos b) -i) , b) -ii) y b) -iii) es secuencial,

c) analizar la muestra incubada según b) mediante una cromatografía líquida acoplada a una espectrometría de masas para detectar el anticuerpo intacto y/o para detectar fragmentos del anticuerpo contenidos en la muestra que se proporciona según a) .

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado de modo que la proteasa de cisteína específica para IgG tiene la secuencia de aminoácidos Id. de Sec. Nº: 1.

3. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-2, caracterizado de modo que la glucosidasa tiene la secuencia de aminoácidos Id. de Sec. Nº: 2.

4. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado de modo que la cromatografía líquida es una cromatografía líquida de fase reversa.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado de modo que la cromatografía emplea un material de cromatografía con residuos C8 o C18.

6. El método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3, caracterizado de modo que la cromatografía líquida es una cromatografía de interacción hidrofóbica.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado de modo que la cromatografía de interacción hidrofóbica emplea un material de cromatografía con residuos de difenilo.

8. La utilización de la proteasa de cisteína IdeS específica para IgG procedente de Streptococcus pyogenes para la detección de anticuerpos IgG y de fragmentos de anticuerpo IgG en una muestra, caracterizado de modo que la muestra se incuba con la proteasa de cisteína específica para IgG y, después de la incubación con la N-glucosidasa F procedente de Flavobacterium meningosepticum, el agente reductor tricloroetilfosfato y el ácido fórmico, los fragmentos obtenidos se analizan mediante una cromatografía líquida acoplada a una espectrometría de masas.

9. Un kit para la detección de anticuerpos IgG y de fragmentos de anticuerpo IgG, caracterizado de modo que el kit contiene

i) la proteasa de cisteína IdeS específica para IgG procedente de S. pyogenes,

ii) la glucosidasa N-glucosidasa F procedente de Flavobacterium meningosepticum, y

iii) tricloroetilfosfato y ácido fórmico.