Un procedimiento de preparación de muestra de muestra(s) que contiene(n) proteína para su análisis posterior,

que comprende:

proporcionar un vehículo sólido que contiene dicha muestra;

proporcionar al menos un pocillo que tiene una entrada, una superficie inferior y un drenaje en dichasuperficie inferior, en la que dicho al menos un pocillo tienen al menos una vía de paso formada en dichasuperficie inferior alrededor de dicho drenaje y que tiene una dimensión mayor más pequeña que ladimensión más pequeña de dicho vehículo;

soportar dicho vehículo en dicha superficie inferior al tiempo que se retienen la comunicación fluida entredicha superficie inferior y dicho drenaje a través de dicha al menos una vía de paso;

digerir dicha proteína en dicha muestra en dicho vehículo añadiendo la solución enzimática;

eluir los péptidos de dicho vehículo añadiendo una solución a dicho pocillo;

que se caracteriza porque

dicha solución enzimática se añade en una cantidad en exceso suficiente para sumergir el vehículo endicho pocillo;

se aplica vacío a dicho pocillo, haciendo que dichos péptidos eluidos fluyan hacia dicho drenaje a travésde dicha al menos una vía de paso.

Dispositivo antiobstrucciones y procedimiento para aplicaciones de digestión en gel

El análisis por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) es una herramienta útil para resolver problemas estructurales e bioquímica, inmunología, genética y biología. Las muestras se ionizan y se usa el analizador del tiempo de vuelo (TOF) para medir las masas iónicas. El análisis TOF comienza cuando se forman iones y se aceleran hasta una energía cinética constante a medida que entran en una región de flujo. Llegan a un detector siguiendo tiempos de vuelo que son proporcionales a la raíz cuadrada de sus masas. Se crea un espectro de masas porque los iones de masa diferente llegan al detector a tiempos diferentes.

La espectrometría de masas puede ser una herramienta particularmente potente en los campos del descubrimiento y desarrollo de fármacos, genotipado e investigación de proteosomas. Las tendencias actuales en la investigación son analizar números cada vez mayores de muestras usando equipos de manipulación automáticos o robots. Las cantidades de muestras individuales proceden de los niveles de nanomoles a los niveles de femtomoles. Como resultado, la instrumentación es cada vez más sensible y existe la necesidad de formatos de manipulación de muestras miniaturizados, de alta densidad y desechables.

La digestión en gel de proteínas es un procedimiento proteómico que tiene muchas etapas de preparación de la muestra antes del análisis de la muestra (tales como MALDI-TOF MS) . En pocas palabras, tras la separación en el gel de electroforesis, las proteínas en una muestra se tiñen para la detección y se cortan las porciones del gel que contiene la proteína de interés. Después, la tinción se elimina de estas porciones de gel y se usa una solución enzimática para digerir de forma selectiva la muestra de proteínas para formar péptidos que migran de la porción del gel a la solución. Tras la purificación de los péptidos se lleva a cabo el análisis de la muestra.

La preparación y análisis simultáneos de múltiples muestras es a menudo deseable. Se han desarrollado placas de múltiples pocillos para ensayos simultáneos, que habitualmente consisten en 96, 384 o 1536 vasos o pocillos de reacción por placa. Sería deseable usar placas de múltiples pocillos también para manipulación y preparación de muestras, tal como la eliminación de sales no deseadas y de sustancias bioquímicas para mejorar la resolución y la selectividad del espectro de masas.

A este respecto, el documento EP 1 151 793 divulga una placa de microtitulación que tiene fondos porosos liófobos. Las piezas de gel que contienen proteínas se colocan en los pocillos de la placa y se digieren con la enzima. La enzima se retira después de las piezas de gel mediante centrifugación y se aplica a una placa transportadora de muestras MALDI para análisis.

No obstante, usando centrifugación para unir, lavar y eluir es un procedimiento que consume tiempo. Además, no es fácilmente adaptable a automatización o robótica. Sería altamente deseable usar el formato de placa de microtitulación para digestión enzimática y captura de proteínas que no requieren centrifugación y que es fácilmente adaptable a automatización.

Otra dificultad es que los tapones de gel son deformables y tienen un diámetro similar a la salida de drenaje en forma de cono de la placa. Cuando se filtran al vacío, los tapones de gel obstruyen la salida y hacen que el pocillo no drene o que rebose con múltiples adiciones de solución, contaminando de este modo los pocillos adyacentes,

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de preparación de muestras para desalar y purificar muestras antes de la ionización-desorción láser asistida con matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o la espectrometría de masas por ionización con electropulverización (ESI) u otros procedimientos de análisis, que también se pueda usar para la digestión de proteínas, en particular la digestión en gel.

Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un dispositivo de múltiples pocillos de alta densidad en el que varias matrices dentro del dispositivo contienen medios cromatográficos que tienen las mismas o diferentes químicas y en las que la digestión en gel de proteínas se lleva a cabo usando vacío como fuerza impulsora.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un sistema de preparación de muestras y un procedimiento que es adecuado para equipos de manipulación de líquidos robóticos automáticos.

Estos y otros objetos serán evidentes a partir de la siguiente descripción.

Sumario de la invención

La presente invención ha superado los problemas de la técnica anterior, cuyas características esenciales y opcionales se establecen en las reivindicaciones principales y subreivindicaciones adjuntas respectivamente. Una realización de la invención proporciona un dispositivo de preparación de muestras proteómicas integrado y un procedimiento para la digestión de proteínas y para desalar y concentrar las muestras antes del análisis posterior, tal como mediante MALDI TOF y/o espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESI) . El dispositivo y el procedimiento de la presente invención permite la digestión, desalación y concentración de las muestras antes del análisis de EM MALDI TOF. Más específicamente, el dispositivo de acuerdo con una realización

de la presente invención incluye una pluralidad de pocillos, cada uno en comunicación fluida con una respectiva salida o abertura de drenaje, que opcionalmente contiene una estructura tridimensional que comprende una pluralidad de partículas de porción atrapadas en una matriz polimérica porosa para formar un dispositivo capaz de llevar a cabo extracción en fase sólida. En una realización preferida, los pocillos se configuran de un modo tal que previenen que un transportador de muestras, tal como una pieza de gel insertada en los pocillos obstruya la salida cuando se somete a una fuerza impulsora tal como un vacío. El dispositivo también reduce o elimina la contaminación cruzada entre pocillos en el caso de que un drenaje se obstruya.

La presente invención está dirigida también a un procedimiento de preparación de muestras usando el dispositivo de la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una vista en perspectiva de un único pocillo para un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos de acuerdo con la presente invención.

La Figura 2 es una vista en perspectiva de un único pocillo para un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos que contienen una pieza de gel de acuerdo con la presente invención.

La Figura 3 es una vista en sección transversal de un único pocillo para un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos que contienen una pieza de gel de acuerdo con la presente invención.

La Figura 4 es una vista en perspectiva con aumento de tamaño de un único pocillo para un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos que contienen una pieza de gel de acuerdo con la presente invención.

La Figura 5 es una vista en sección transversal de un único pocillo para un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos que contienen una pieza de gel (en fantasma) y una matriz que tiene propiedades de adsorción en el drenaje de acuerdo con la presente invención.

La Figura 5A es una vista desde arriba de vías de paso de fluido formadas en un pocillo de acuerdo con la presente invención.

La Figura 6 es una vista en perspectiva de dos pocillos adyacentes de un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos de acuerdo con la presente invención.

La Figura 7 es una vista en perspectiva de un sólido que sale del drenaje y de las vías de paso de acuerdo con la presente invención.

La Figura 8 es una vista en sección transversal de un único pocillo para un dispositivo para preparación de muestras de múltiples pocillos que contienen una pieza de gel (en fantasma) y una matriz que tiene propiedades de adsorción en el drenaje de acuerdo con una realización alternativa de la presente invención.

La Figura 8A es una vista desde arriba de vías de paso de fluido... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de muestra de muestra (s) que contiene (n) proteína para su análisis posterior, que comprende:

proporcionar un vehículo sólido que contiene dicha muestra;

proporcionar al menos un pocillo que tiene una entrada, una superficie inferior y un drenaje en dicha superficie inferior, en la que dicho al menos un pocillo tienen al menos una vía de paso formada en dicha superficie inferior alrededor de dicho drenaje y que tiene una dimensión mayor más pequeña que la dimensión más pequeña de dicho vehículo;

soportar dicho vehículo en dicha superficie inferior al tiempo que se retienen la comunicación fluida entre dicha superficie inferior y dicho drenaje a través de dicha al menos una vía de paso;

digerir dicha proteína en dicha muestra en dicho vehículo añadiendo la solución enzimática;

eluir los péptidos de dicho vehículo añadiendo una solución a dicho pocillo;

que se caracteriza porque

dicha solución enzimática se añade en una cantidad en exceso suficiente para sumergir el vehículo en dicho pocillo;

se aplica vacío a dicho pocillo, haciendo que dichos péptidos eluidos fluyan hacia dicho drenaje a través de dicha al menos una vía de paso.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que a) hay tres vías de paso dispuestas de forma simétrica alrededor de dicho drenaje, y/o b) dichos péptidos se absorben en dicho drenaje mediante una estructura de adsorción colocada en

dicho drenaje y, opcionalmente, dicha estructura comprende una pluralidad de partículas de porción atrapadas en una matriz porosa y/o c) dicho vehículo comprende un gel y/o d) dicho vehículo comprende una membrana.

3. Un procedimiento de preparación de muestra de muestra (s) que contiene (n) proteína para su análisis posterior, que comprende:

proporcionar una pluralidad de vehículos sólidos que contienen dicha muestra;

proporcionar una matriz de pocillos, teniendo cada pocillo una entrada, una superficie inferior y un drenaje en dicha superficie inferior, en la que cada pocillo tienen al menos una vía de paso formada en dicha superficie inferior alrededor de dicho drenaje y que tiene una dimensión más pequeña que la dimensión más pequeña de uno de dicha pluralidad de vehículos;

soportar un correspondiente uno de dicha pluralidad de vehículos en dicha superficie inferior de cada uno de dichos pocillos, al tiempo que se retienen la comunicación fluida entre dicha superficie inferior y dicho drenaje a través de dicha al menos una vía de paso;

digerir dicha proteína en dicha muestra en cada uno de dichos vehículos añadiendo la solución enzimática;

eluir los péptidos de cada uno de dichos vehículos añadiendo una solución a cada uno de dichos pocillos;

que se caracteriza porque

dicha solución enzimática se añade en una cantidad en exceso en cada pocillo, suficiente para sumergir el vehículo en el mismo;

simultáneamente se aplica vacío a cada uno de dichos pocillo, haciendo que dichos péptidos eluidos fluyan desde dicho vehículo hacia dicho drenaje a través de dicha al menos una vía de paso en cada uno de dichos pocillos.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho vehículo comprende un gel.

5. Un montaje de la preparación de muestras, que comprende:

un dispositivo de preparación de muestras que comprende al menos un pocillo adaptado para contener 6

un vehículo de muestras, teniendo dicho al menos un pocillo una entrada, una superficie inferior y un drenaje en dicha superficie inferior, en el que dicho al menos un pocillo tiene al menos una vía de paso formada en dicha superficie inferior alrededor de dicho drenaje;

que se caracteriza por una fuente de vacío en comunicación fluida con dicho pocillo.

6. El ensamblaje de la reivindicación 5, en el que dicha al menos una vía de paso que tiene una dimensión menor de 1, 0 mm.

7. El ensamblaje de la reivindicación 5 o 6, en el que hay tres vías de paso dispuestas simétricamente alrededor de dicho drenaje.

8. El ensamblaje de la reivindicación 5, 6 o 7, en el que una estructura de adsorción se coloca en dicho drenaje y, 10 opcionalmente, dicha estructura comprende una pluralidad de partículas de sorción atrapadas en una matriz porosa.

9. El ensamblaje de la reivindicación 5, 6, 7 u 8, en el que hay una pluralidad de dichos pocillos.

10. El ensamblaje de la reivindicación 9, en el que dicha pluralidad de pocillos está rodeada por un rebajo.

11. El ensamblaje de la reivindicación 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en el que dicha al menos vía de paso está formada por al menos una protuberancia en la superficie inferior de dicho pocillo.

12. Un ensamblaje de preparación de muestras, que comprende:

un dispositivo de preparación de muestras que comprende una pluralidad de pocillos adaptados para contener un transportador de muestras, teniendo cada pocillo una entrada, una superficie inferior y un drenaje en dicha superficie inferior en el que cada pocillo tiene al menos dos vías de paso formadas en dicha superficie inferior alrededor de dicho drenaje;

que se caracteriza por una fuente de vacío en comunicación fluida con cada uno de dichos pocillos.