Un dispositivo microfluídico que comprende:

(a) una primera región de obstáculos fijos dispuestos en un canal microfluídico que define una vía de flujo de líquido,

en el que los obstáculos de la primera región se unen preferentemente a un primer tipo de célula comparado con un segundo tipo de célula, en el que l 5 os obstáculos están colocados en al menos dos columnas y al menos dos filas, en el que las filas están colocadas perpendiculares a la vía de flujo de líquido en relación con los obstáculos de la fila anterior, formando de este modo un conjunto de obstáculos triangular equilátero; y

(b) una segunda región de obstáculos fijos dispuestos en el canal microfluídico, en el que los obstáculos de la segunda región se unen preferentemente a un tercer tipo de célula comparado con un cuarto tipo de célula, en el que los obstáculos están colocados en al menos dos columnas y al menos dos filas, en el que las filas están colocadas perpendiculares a la vía de flujo de líquido y los obstáculos de cada fila sucesiva están desplazados en una dirección perpendicular a la vía de flujo de líquido en relación con los obstáculos de la fila anterior, formando de este modo un conjunto de obstáculos triangular equilátero, en el que la segunda región está situada más allá de la primera región en el canal microfluídico.

Dispositivo microfluídico para separación de células y sus usos

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a los campos del diagnóstico médico y los microfluidos.

Existen varios enfoques diseñados para separar una población de células homogéneas de la sangre. Estas técnicas de separación de células pueden agruparse en dos amplias categorías: (1) procedimientos invasivos basados en la selección de células fijadas y teñidas usando diversos marcadores específicos de célula; y (2) procedimientos no invasivos para el aislamiento de células vivas usando un parámetro biofísico específico de una población de células de interés.

Las técnicas invasivas incluyen separación de células activadas por fluorescencia (FACS) , separación de células activadas magnéticamente (MACS) y separación de coloides inmunomagnética. Normalmente, la FACS es una técnica de selección positiva que usa un marcador marcado de manera fluorescente para unirse a células que expresan un marcador de superficie celular específico. La FACS también puede usarse para permeabilizar y teñir células para marcadores intracelulares que pueden constituir la base de la separación. Es rápida, normalmente funciona a una velocidad de 1.000 a 1.500 Hz y está bien establecida en la medicina de laboratorio. Se asocian índices elevados de falsos positivos con la FACS por el bajo número de fotones obtenido durante los tiempos de permanencia extremadamente cortos a altas velocidades. Pueden usarse complicados enfoques de separación multiparamétricos para potenciar la especificidad de la FACS, pero la FACS a base de múltiples analitos puede no ser práctica para los ensayos clínicos rutinarios debido al alto coste asociado a ella. La aplicación clínica de FACS está limitada además porque requiere una pericia del operador considerable, es laboriosa, da como resultado pérdida de células debido a las múltiples manipulaciones y el coste del equipo es prohibitivo.

La MACS se usa como técnica de separación de células en la que las células que expresan un marcador de superficie específico se aíslan a partir de una muestra de células usando perlas magnéticas recubiertas con un anticuerpo contra el marcador de superficie. La MACS tiene la ventaja de ser más barata, más fácil y más rápida de realizar comparada con la FACS. Se ve afectada por pérdida de células debido a las múltiples manipulaciones y el manejo. Además, a menudo las perlas magnéticas son autofluorescentes y no se separan fácilmente de las células. Como resultado, muchas de las técnicas de inmunofluorescencia usadas para investigar las funciones y la estructura celular no son compatibles con este enfoque.

Se ha usado un sistema de coloides magnético en el aislamiento de células de sangre. Este sistema de coloides usa nanopartículas ferromagnéticas que están recubiertas con IgG de cabra anti-ratón que puede unirse fácilmente a anticuerpos monoclonales específicos de antígeno de la superficie celular. Las células que están marcadas con nanopartículas ferromagnéticas se alinean con un campo magnético a lo largo de líneas de Ni ferromagnéticas depositadas mediante técnicas litográficas sobre una superficie ópticamente transparente. Este enfoque también requiere múltiples etapas de manejo de células que incluyen mezclar células con perlas magnéticas y separación sobre las superficies. Tampoco es posible separar las células individuales de la muestra para análisis adicional.

Las técnicas no invasivas incluyen la separación por flujo de carga, que emplea un gradiente líquido de flujo cruzado horizontal opuesto a un campo eléctrico con el fin de separar células en función de sus densidades de carga de superficie características. A pesar de que este enfoque puede separar células basándose puramente en diferencias biofísicas, no es lo suficientemente específico. Ha habido intentos de modificar las características del dispositivo (p. ej., pantallas del separador, condiciones del flujo a contracorriente de tampón, etc.) para tratar este gran inconveniente de la técnica. Ninguna de estas modificaciones de características del dispositivo ha proporcionado una solución práctica dada la variabilidad individual esperada en muestras diferentes.

Dado que los procedimientos de la técnica anterior se ven afectados por un alto coste, bajo rendimiento y falta de especificidad, existe una necesidad de un procedimiento para retirar un tipo de célula concreto de una mezcla que supere estas limitaciones.

El documento US 5.866.345 divulga un dispositivo para detectar la presencia de un analito en una muestra líquida, comprendiendo el dispositivo: un sustrato sólido microfabricado para que defina: un puerto de entrada de muestra; un sistema de flujo en mesoescala que comprende: un canal de flujo de muestra en comunicación fluida con dicho puerto de entrada; y una región de detección de analito en comunicación fluida con dicho canal de flujo que comprende un resto de unión inmovilizado en él para unir dicho analito específicamente, teniendo dicha región de detección una dimensión en mesoescala; y una ventana de detección dispuesta en dicha región de detección para transmitir una señal que indica la unión de dicho analito a un medio de detección dispuesto adyacente a dicha ventana.

El documento US 2002/0115201 A1 divulga un dispositivo microfluídico que comprende: un circuito integrado monolítico de microondas (MMIC) dentro de dicho dispositivo microfluídico para aplicar radiación de microondas a una cavidad definida por dicho dispositivo microfluídico.

El documento US 6.613.525 B2 divulga un dispositivo microfluídico integrado que tiene al menos un microcanal formado en un sustrato generalmente plano, comprendiendo dicho dispositivo: al menos un microcanal que comprende una porción de canal de enriquecimiento que tiene al menos una entrada y una salida; y un medio de enriquecimiento presente en dicha porción de canal de enriquecimiento y que contiene restos de unión específica que se unen a un objetivo de una muestra de forma que al menos una fracción del objetivo es retenido por dicho medio de enriquecimiento; dicha porción de canal de enriquecimiento está configurada para (i) recibir, a través de dicha entrada, la muestra que contiene el objetivo y (ii) permitir el movimiento de al menos una parte del objetivo unido a través de dicha salida.

Los documentos US 6.344.326 B1 y US 6.074.827 se refieren respectivamente a un procedimiento microfluídico para purificación y procesamiento de ácidos nucleicos. Pueden usarse en el procedimiento microcanales o receptores de captura por afinidad dispuestos en una zona de enriquecimiento.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto, se proporciona un dispositivo microfluídico, el cual comprende:

(a) una primera región de obstáculos fijos dispuestos en un canal microfluídico que define una vía de flujo de líquido, en el que los obstáculos de la primera región se unen preferentemente a un primer tipo de célula comparado con un segundo tipo de célula, en el que los obstáculos están colocados en al menos dos columnas y al menos dos filas, en el que las filas están colocadas perpendiculares a la vía de flujo de líquido en relación con los obstáculos de la fila anterior, formando de este modo un conjunto de obstáculos triangular equilátero;y

(b) una segunda región de obstáculos fijos dispuestos en el canal microfluídico, en el que los obstáculos de la segunda región se unen preferentemente a un tercer tipo de célula comparado con un cuarto tipo de célula, en el que los obstáculos están colocados en al menos dos columnas y al menos dos filas, en el que las filas están colocadas perpendiculares a la vía de flujo de líquido y los obstáculos de cada fila sucesiva están desplazados en una dirección perpendicular a la vía de flujo de líquido en relación con los obstáculos de la fila anterior, formando de este modo un conjunto de obstáculos triangular equilátero,

en el que la segunda región está situada más allá de la primera región en el canal microfluídico.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un uso del dispositivo como se indica en la reivindicación independiente. Las reivindicaciones dependientes definen realizaciones.

El dispositivo puede usarse en procedimientos para separar células de una muestra (p. ej., separar glóbulos rojos fetales de sangre materna) .

El procedimiento empieza con la introducción de una muestra que incluye células en uno o más... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo microfluídico que comprende:

(a) una primera región de obstáculos fijos dispuestos en un canal microfluídico que define una vía de flujo de líquido, en el que los obstáculos de la primera región se unen preferentemente a un primer tipo de célula comparado con un segundo tipo de célula, en el que los obstáculos están colocados en al menos dos columnas y al menos dos filas, en el que las filas están colocadas perpendiculares a la vía de flujo de líquido en relación con los obstáculos de la fila anterior, formando de este modo un conjunto de obstáculos triangular equilátero; y

(b) una segunda región de obstáculos fijos dispuestos en el canal microfluídico, en el que los obstáculos de la segunda región se unen preferentemente a un tercer tipo de célula comparado con un cuarto tipo de célula, en el que los obstáculos están colocados en al menos dos columnas y al menos dos filas, en el que las filas están colocadas perpendiculares a la vía de flujo de líquido y los obstáculos de cada fila sucesiva están desplazados en una dirección perpendicular a la vía de flujo de líquido en relación con los obstáculos de la fila anterior, formando de este modo un conjunto de obstáculos triangular equilátero,

en el que la segunda región está situada más allá de la primera región en el canal microfluídico.

2. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en el que los obstáculos están recubiertos con un anticuerpo.

3. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1 o 2, en el que un espaciado entre obstáculos es de al menos 50 μm.

4. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un espaciado entre obstáculos es de 100 μm como máximo.

5. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los obstáculos de la primera región, la segunda región, o ambas regiones primera y segunda, son de tamaño sustancialmente uniforme.

6. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una bomba.

7. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dispositivo es ópticamente transparente o tiene ventanas transparentes.

8. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los obstáculos están en contacto tanto con la parte superior como con la inferior de la cámara.

9. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los obstáculos tienen una sección transversal cilíndrica.

10. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el dispositivo está fabricado a partir de un polímero.

11. El dispositivo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los obstáculos están colocados para permitir el flujo de células sin que sean comprimidas mecánicamente entre los obstáculos y, por tanto, dañadas, durante el proceso del flujo.

12. El uso de un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para diagnóstico médico.