Dispositivo de detección de enzimas.

Un dispositivo de detección de enzimas para la detección de la presencia en una muestra de una enzima capazde modificar un sustrato proporcionado que comprende:

(i) un medio cromatográfico o un soporte sólido

(ii) un sustrato que comprende una región de unión y una región de modificación sensible a la modificación porla enzima de un estado no modificado a un estado modificado;

(iii) una primera molécula de reconocimiento de la captura inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico oen el soporte sólido capaz de unir la región de unión del sustrato;

(iv) una molécula de reconocimiento del sustrato capaz de unir específicamente la región de modificación en elestado no modificado, siendo el sitio de unión de la molécula de reconocimiento del sustrato, de tal forma quela región de modificación del sustrato se une preferencialmente a dicha molécula de reconocimiento delsustrato, comparado con la enzima cuando está mezclada y

(v) un indicador detectable unido a la molécula de reconocimiento del sustrato.

Dispositivo de detección de enzimas

La presente invención se refiere a un dispositivo de detección de enzimas y, más específicamente a un dispositivo de detección de enzimas para detectar una enzima capaz de modificar un sustrato proporcionado que es reconocible mediante una molécula de unión específica en su estado no modificado. La invención también se refiere a un procedimiento de detección de una enzima capaz de modificar un sustrato.

Existen muchas situaciones clínicas y experimentales, en las que es útil poder detectar la presencia, en una muestra, de una enzima que tiene una actividad catalítica particular. Un ejemplo de este tipo de enzima es una proteasa, la cual digiere proteínas por hidrolización y escisión de enlaces peptídicos. Por lo tanto, una proteína que es degradada por una proteasa se escinde en dos o más péptidos más pequeños. Otro ejemplo es una sialidasa, la cual escindirá un resto de ácido siálico de un carbohidrato más grande.

En el documento US2006/0003394 se divulga un kit de ensayo diagnóstico que detecta una enzima en una muestra. El kit comprende “complejos reactivos”, los cuales comprenden cada uno de ellos un ligando diana unido a un marcador y un miembro de unión específico. El ligando diana es escindible por la enzima que se va a detectar con el fin de liberar el marcador. La mezcla de los complejos reactivos y la muestra se aplica posteriormente a un medio cromatográfico. El medio cromatográfico comprende una primera zona de detección, la cual es capaz de capturar el miembro de unión específico en el ligando diana y una segunda zona de detección, la cual es capaz de unirse al marcador. Por consiguiente, durante el uso, la mezcla de la muestra y los complejos reactivos se aplican al medio cromatográfico y fluye primero a través de la primera zona de detección y después a través de la segunda zona de detección. En la primera zona de detección, se captura el ligando diana. Cualquier enzima de la muestra escinde el marcador del ligando diana y el marcador escindido se captura en la segunda zona de detección, dejando cualquier marcador restante no escindido unido al ligando diana en la primera zona de detección. Por consiguiente, la presencia de la enzima en la muestra se determina mediante la presencia del marcador en la segunda zona de detección (o la ausencia del marcador de la primera zona de detección) .

Un problema con el kit divulgado en el documento US2006/0003394 es que el kit puede tender a dar resultados inexactos debido a que la enzima continúa siendo activa mientras la mezcla fluye a lo largo del medio cromatográfico. La enzima escinde a continuación el marcador del ligando diana mientras que los complejos reactivos están inmovilizados en la primera zona de captura. Por lo tanto, la señal en la primera zona de detección y en la segunda zona de detección puede tender a variar a lo largo del tiempo, no siendo claro el punto final de la reacción.

Otro problema del kit divulgado en el documento US2006/0003394 es que sólo puede detectar una enzima que escinde el ligando diana y no es capaz de detectar enzimas que tengan otros efectos, tales como restos de adición a un ligando diana (por ej., fosforilación o glucolización) .

Otro problema del kit divulgado en el documento US2006/0003394 es que no puede detectar la actividad de enzimas que tienen que escindir el extremo terminal del ligando diana, tal como una exopeptidasa, o una exocarbohidrasa, debido a que el requisito de unión de un marcador al extremo terminal cambiaría la naturaleza química del extremo terminal en un grado que evitaría la interacción con el sitio activo de la enzima.

La presente invención busca aliviar uno o más de los problemas anteriores.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un dispositivo de detección de enzimas para la detección de la presencia en una muestra de una enzima capaz de modificar un sustrato proporcionado que comprende:

(i) un medio cromatográfico o un soporte sólido

(ii) un sustrato que comprende una región de unión y una región de modificación sensible a la modificación por la enzima de un estado no modificado a un estado modificado;

(iii) una primera molécula de reconocimiento de la captura inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico o en el soporte sólido capaz de unir la región de unión del sustrato;

(iv) una molécula de reconocimiento del sustrato capaz de unir específicamente la región de modificación en el estado no modificado, siendo el sitio de unión de la molécula de reconocimiento del sustrato , de tal forma que la región de modificación del sustrato se une preferencialmente a dicha molécula de reconocimiento del sustrato, comparado con la enzima cuando está mezclada y

(v) un indicador detectable unido a la molécula de reconocimiento del sustrato.

Ventajosamente, la afinidad de la molécula de reconocimiento del sustrato por el sustrato comprende una tasa de disociación relativamente baja (kd) .

Preferiblemente, la afinidad de la molécula de reconocimiento del sustrato por el sustrato comprende una tasa de disociación relativamente baja (kd) y una tasa de asociación relativamente alta (ka) .

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Preferiblemente, la tasa de disociación (kd) de la molécula de reconocimiento del sustrato está entre 10-4.s-1 y 10-7.s 1, más preferiblemente entre 10-5.s-1 y 10-6.s-1.

Preferiblemente, la tasa de asociación (kd) de la molécula de reconocimiento del sustrato está entre 10-5.s-1 y 10-9.s-1, más preferiblemente entre 107.s-1 y 108.s-1.

Ventajosamente, la molécula de reconocimiento del sustrato tiene una tasa de disociación (kd) más baja y una tasa de asociación (ka) más alta por el sustrato que la enzima tiene por el sustrato.

Preferiblemente, el medio cromatográfico comprende además una segunda molécula de reconocimiento de la captura, inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico y capaz de unir la molécula de reconocimiento del sustrato, opcionalmente en combinación con un fragmento del sustrato.

Ventajosamente, la primera molécula de reconocimiento del sustrato y la región de unión y/o la segunda molécula de reconocimiento de la captura y la molécula de reconocimiento del sustrato son cada una de ellas dos mitades de un par, en el que el par de unión es: un antígeno y un fragmento de unión al anticuerpo o al antígeno específico del mismo; biotina y avidina, estreptavidina, neutravidina o captavidina; proteína A y G; un carbohidrato y una lectina; dos secuencias de nucleótidos complementarias; una molécula efectora y una receptora; una hormona y una proteína de unión a hormonas; un cofactor enzimático y una enzima; un inhibidor enzimático y una enzima; un dominio de unión a celulosa y fibras de celulosa; ácido aminofenilborónico inmovilizado y moléculas portadoras cisdiol; xiloglucano y fibras de celulosa y análogos, derivados y fragmentos de los mismos.

Convenientemente, la molécula de reconocimiento del sustrato es un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno; una lectina; una secuencia de nucleótidos; una molécula de receptor; o una proteína de unión a hormona capaz de unir la región de modificación en estado modificado o en estado no modificado.

Alternativamente, la molécula de reconocimiento del sustrato es avidina, estreptavidina, neutravidina, o captavidina capaz de unir biotina no modificada.

Preferiblemente, la enzima es una hidrolasa, preferiblemente una peptidasa, lipasa, nucleasa, carbohidrasa, fosfatasa, sulfatasa, neuraminidasa, esterasa, ADNasa o ARNasa.

Alternativamente, la enzima es una quinasa, una glucosiltransferasa, una oxidasa, una reductasa o una transaminasa.

Convenientemente, el indicador detectable está covalentemente unido a la molécula de reconocimiento del sustrato.

Preferiblemente, el indicador detectable es un fluroforo, una partícula de oro, un cromógeno, un compuesto luminiscente; un compuesto radiactivo; un compuesto visible, un liposoma u otra vesícula que contiene sustancias productoras de señales, una especie electroactiva o una combinación de una enzima y su sustrato.

Ventajosamente, el dispositivo de detección de enzimas comprende un primer y segundo sustratatos, comprendiendo cada uno de ellos... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo de detección de enzimas para la detección de la presencia en una muestra de una enzima capaz de modificar un sustrato proporcionado que comprende:

(i) un medio cromatográfico o un soporte sólido

(ii) un sustrato que comprende una región de unión y una región de modificación sensible a la modificación por la enzima de un estado no modificado a un estado modificado;

(iii) una primera molécula de reconocimiento de la captura inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico o en el soporte sólido capaz de unir la región de unión del sustrato;

(iv) una molécula de reconocimiento del sustrato capaz de unir específicamente la región de modificación en el estado no modificado, siendo el sitio de unión de la molécula de reconocimiento del sustrato, de tal forma que la región de modificación del sustrato se une preferencialmente a dicha molécula de reconocimiento del sustrato, comparado con la enzima cuando está mezclada y

(v) un indicador detectable unido a la molécula de reconocimiento del sustrato.

2. Un dispositivo de detección de enzimas de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la región de unión es un ligando no modificable.

3. Un dispositivo de detección de enzimas de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende además una segunda molécula de reconocimiento de la captura, inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico y capaz de unir la molécula de reconocimiento del sustrato, opcionalmente en combinación con un fragmento del sustrato.

4. Un dispositivo de detección de enzimas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la enzima es una hidrolasa, preferiblemente una peptidasa, lipasa, nucleasa, carbohidrasa, fosfatasa, sulfatasa, neuraminidasa, esterasa, ADNasa, ARNasa, una quinasa, una glucosiltransferasa, una oxidasa, una reductasa o una transaminasa.

5. Un dispositivo de detección de enzimas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el indicador detectable está covalentemente unido a la molécula de reconocimiento del sustrato y/o en el que el indicador es un fluoroforo, una partícula de oro, un cromógeno, un compuesto luminiscente, un compuesto radiactivo, un compuesto visible, un liposoma u otra vesícula que contiene sustancias productoras de señales, una especie electroactiva o una combinación de una enzima y su sustrato.

6. Un dispositivo de detección de enzimas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un primer y segundo sustratatos, comprendiendo cada uno de ellos una región de modificación, siendo la región de modificación del primer sustrato sensible a la modificación por una primera enzima, siendo la región de modificación del segundo sustrato sensible a la modificación por una segunda enzima.

7. Un procedimiento de detección de una enzima capaz de modificar un sustrato que comprende los pasos de:

(i) proporcionar un sustrato que comprende una región de unión y una región de modificación sensible a la modificación por la enzima de un estado no modificado a un estado modificado, proporcionando un soporte sólido y uniendo la región de unión del sustrato al soporte sólido, proporcionando una primera molécula de reconocimiento de la captura, capaz de unir la región de unión sobre el soporte sólido;

(ii) proporcionar una muestra sospechosa de contener una enzima;

(iii) proporcionar una molécula de reconocimiento del sustrato a la cual se acopla un indicador detectable, en la que la molécula de reconocimiento del sustrato une específicamente la región de modificación en el estado no modificado, siendo el sitio de unión de la molécula de reconocimiento del sustrato, de tal forma que la región de modificación del sustrato se une preferencialmente a dicha molécula de reconocimiento del sustrato, comparado con la enzima cuando está mezclada;

(iv) mezclar la muestra y el sustrato, de tal forma que al menos parte de la enzima de la muestra modifique el sustrato;

(v) poner en contacto el sustrato y la molécula de reconocimiento del sustrato y detectar la presencia del indicador; o

(i) proporcionar un sustrato que comprende una región de unión y una región de modificación sensible a la modificación por la enzima de un estado no modificado a un estado modificado;

(ii) proporcionar una muestra sospechosa de contener una enzima;

(iii) proporcionar una molécula de reconocimiento del sustrato a la cual se acopla un indicador detectable, en la que la molécula de reconocimiento del sustrato une específicamente la región de modificación en el estado no modificado, siendo el sitio de unión de la molécula de reconocimiento del sustrato, de tal forma que la región de modificación del sustrato se une preferencialmente a dicha molécula de reconocimiento del sustrato, comparado con la enzima cuando está mezclada;

(iv) mezclar la muestra y el sustrato, de tal forma que al menos parte de la enzima de la muestra modifique el sustrato;

(v) depositar el sustrato y la molécula de reconocimiento del sustrato sobre o en un medio cromatográfico,

en el que el medio cromatográfico comprende una primera molécula de reconocimiento de la captura inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico, siendo la primera molécula de reconocimiento del sustrato capaz de unir la región de unión, poner en contacto el sustrato y la molécula de reconocimiento del sustrato y detectar la presencia del indicador.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en el que la región de unión es un ligando no modificable.

9. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 7 ó 8 que comprende además una segunda molécula de reconocimiento de la captura inmovilizada sobre o en el medio cromatográfico, siendo la segunda molécula de reconocimiento de la captura capaz de unir la molécula de reconocimiento del sustrato, opcionalmente en combinación con un fragmento del sustrato, en el que el procedimiento comprende el paso de detectar la presencia de la molécula de reconocimiento del sustrato en la segunda molécula de reconocimiento de la captura.

10. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que la enzima es una hidrolasa, preferiblemente una peptidasa, lipasa, nucleasa, homooligosacaridasa o heterooligosacaridasa, homopolisacaridasa o heteropolisacaridasa, carbohidrasa, fosfatasa, sulfatasa, neuraminidasa, esterasa, ADNasa, ARNasa, una quinasa, una glucosiltransferasa, una oxidasa, una reductasa o una transaminasa.

11. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 el indicador detectable está covalentemente unido a la molécula de reconocimiento del sustrato y/o en el que el indicador es un fluoroforo, una partícula de oro, un cromógeno, un compuesto luminiscente; un compuesto radiactivo, un compuesto visible, un liposoma u otra vesícula que contiene sustancias productoras de señales, una especie electroactiva o una combinación de una enzima y su sustrato.

12. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en el que el paso (i) comprende proporcionar un primer y segundo sustratatos, comprendiendo cada uno de ellos una región de modificación, siendo la región de modificación del primer sustrato sensible a la modificación por una primera enzima, siendo la región de modificación del segundo sustrato sensible a la modificación por una segunda enzima y en el que el paso (v) comprende la detección de la interacción entre el primer y segundo sustratos y la molécula de reconocimiento del sustrato.

13. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en el que el paso (iii) comprende proporcionar una primera y segunda moléculas de reconocimiento del sustrato, uniendo cada una de ellas específicamente la región de modificación del primer y segundo sustratos, respectivamente, en el estado no modificado, siendo la región de modificación del primer sustrato preferencialmente unida por dicha primera molécula de reconocimiento del sustrato comparado con la primera enzima y siendo la región de modificación del segundo sustrato preferencialmente unida por dicha segunda molécula de reconocimiento del sustrato comparado con la segunda enzima y en el que el paso (v) comprende la detección de la interacción entre el primer y segundo sustratos y la primera y segunda moléculas de reconocimiento del sustrato.