Un método para determinar el hematocrito de una muestra de sangre que comprende las etapas de:

depositar la muestra en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12), y una superficie interior (18) de un segundo panel (16), en la que ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16), siendo dicha altura tal que al menos algunas células sanguíneas rojas dentro de la muestra están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16), y una o más zonas vacías de células rojas dentro de la muestra quiescente se extienden entre la superficies interiores (14,18),

captar imágenes de al menos una parte de la muestra quiescente, la cual contiene las células sanguíneas rojas y 10 una o más zonas vacías de células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14,18), para determinar un valor de densidad óptica de la parte de la muestra de la que se han captado las imágenes con un criterio por unidad de imagen,

seleccionar y calcular los valores medios de los valores de densidad óptica de las unidades de imagen ópticamente alineadas con las células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) y, asignar un valor límite superior de 100% a valor medio de densidad óptica de esas unidades de imagen;

seleccionar y calcular el valor medio de los valores de densidad óptica de las unidades de imagen ópticamente alineadas con una o más zonas vacías de las células sanguíneas rojas, y asignar una valor límite inferior de 0% a los valores de densidad óptica de esas unidades de imagen; y

determinar el hematocrito de la muestra asignando valores relativos al valor de densidad óptica de cada unidad de 20 imagen de la parte de la muestra de la que se captan imágenes, en función de los valores límites superior e inferior, y calculando el valor medio de los valores relativos.

Procedimiento y aparato para determinar el hematocrito de una muestra de sangre utilizando la pigmentación intrínseca de la hemoglobina contenida en los glóbulos rojos.

Antecedentes de la invención

1. Campo técnico

La presente invención se refiere aparatos y métodos para el análisis de muestras de sangre en general, y para la determinación del hematocrito de una muestra de sangre en particular.

2. Información de los antecedentes

Médicos, veterinarios y científicos han examinado fluidos biológicos de humanos y animales, especialmente sangre, para determinar sus cantidades de partículas constituyentes así como para identificar la presencia de partículas inusuales no vistas en sujetos saludables. Las partículas generalmente medidas, cuantificadas e identificadas incluyen células sanguíneas rojas (RBC) , células sanguíneas blancas (WBC) y plaquetas. Los análisis de RBC pueden incluir determinaciones del número, tamaño volumen, forma, contenido y concentración de hemoglobina de RBC, y el hematocrito (también denominado el volumen relleno de células) . Los análisis de RBC pueden implicar también la determinación de la presencia y/o concentración de ciertos componentes dentro de las células sanguíneas rojas tales como ADN, ARN, incluyendo la detección de la presencia y/o enumeración de hematoparásitos (por ejemplo parásitos de malaria) o bien en las RBC o tripanosomas que son extracelulares u organismos de leismaniasis que están en las WBC así como otros hematoparásitos. Los análisis de WBC pueden incluir una determinación de la frecuencia de población de subtipos de WBC denominado generalmente un recuento de WBC diferencial, así como la notificación de cualquier tipo de célula inusual no encontrada en individuos saludables. Los análisis de plaquetas (o en cientos animales que incluyen pájaros, reptiles y peces, trombocitos que tienen una función similar a la de las plaquetas en los mamíferos pero que son aproximadamente diez veces más grandes y están nucleados) pueden incluir el número, tamaño, forma, textura de las plaquetas y determinaciones volumétricas, incluyendo la determinación de la presencia de aglomeraciones de plaquetas o trombocitos dentro de la muestra.

Las técnicas de examen de sangre conocidas, descritas con detalle en textos médicos tales como Wintrobe’s Clinical Hematology 12ª Edición, generalmente dividen los métodos de examen en métodos de tipo manuales, de centrifugado y de impedancia. Los métodos manuales para la enumeración de células implican típicamente la creación de un volumen determinado con exactitud de una muestra de sangre o fluido que está cuantitativamente diluida y recontada visualmente en una cámara de recuento. Los métodos de examen manual incluyen examinar un frotis periférico en el que se determinan las cantidades relativas de los tipos de partículas mediante inspección visual. Los métodos de examen de centrifugado incluyen el centrifugado de la muestra, causando la separación de la muestra en capas de constituyentes según las densidades relativas de dichos constituyentes. Se puede teñir cada capa de componente para mejorar la visibilidad o detección. Los métodos de impedancia implican el examen de una cantidad exacta de sangre que se trata según las partículas que se van a medir, por ejemplo, lisando RBC para la enumeración de las células nucleadas y diluyendo volumétricamente la muestra en un fluido conductor. El procedimiento implica típicamente monitorizar una corriente o voltaje aplicado a la muestra que pasa a través de un paso estrecho para determinar el efecto que las partículas tienen sobre la corriente/voltaje a medida que las partículas pasan a través en una única fila. Otras técnicas implican analizar la intensidad y ángulo de dispersión de luz incidente para las partículas que pasan en una única fila a través de un haz de luz. Se pueden usar también métodos citométricos de flujo que implican teñir las partículas de interés en suspensión con fluoróforos, excitar las partículas teñidas con luz de longitudes de onda apropiadas, y analizar la emisión de las partículas/células individuales. El documento US-6235536-B describe el análisis de muestras de sangre entera anticoaguladas quiescentes.

Todos los métodos mencionados anteriormente, aparte del frotis periférico o la separación centrífuga, requieren dispensar un volumen exacto de muestra. Las imprecisiones en el volumen de muestra darán lugar a errores cuantitativos de la misma magnitud en el análisis asociado. Con excepción de las métodos de centrifugado, todos los métodos mencionados anteriormente requieren también que la muestras se mezcle con un o más reactivos o diluyentes líquidos, y también requieren la calibración del instrumento para obtener resultados exactos. En el caso de los frotis periféricos, se necesita un alto grado de capacitación para examinar apropiadamente el frotis. Varios de los métodos anteriormente mencionados generan grandes volúmenes de residuos contaminados que resultan caros de manejar. Además, los métodos descritos anteriormente no son adecuados para determinar el recuento de sangre completo (CBC) en pájaros, reptiles, peces y ciertos mamíferos en los que el tamaño de las células sanguíneas rojas es muy pequeño.

A pesar de la cantidad compleja de información hematológica que se obtiene del recuento completo de sangre, a menudo un ensayo es el más necesario: el hematocrito. Es el hematocrito lo que le dice al médico si el paciente tiene anemia debido a hemorragias o causas nutricionales tales coma la deficiencia en hierro relativamente común en niños en crecimiento y mujeres en edad de reproducción, procesos asociados a trastornos tales como infecciones crónicas, trastornos metabólicos tales uremia o enfermedades neoplásticas así como efectos farmacológicos. Un valor elevado de hematocrito indica la presencia de demasiadas células sanguíneas rojas debido a procesos de trastornos tales como deshidratación en las que la sangre está concentrada. Un valor elevado de hematocrito puede ser indicativo también de aumentos reales en la masa de células sanguíneas rojas que ocurre como consecuencia de procesos de trastornos tales como policitemia, o efectos farmacológicos tales como la administración de demasiados esteroides anabólicos o de hipoxia crónica debido a trastornos de los pulmones o ciertos tipos de trastornos cardíacos congénitos. La importancia y utilidad del hematocrito hacen que sea uno de los ensayos más frecuentemente solicitados realizados en sangre. Como consecuencia, las determinaciones de hematocrito fáciles, exactas, económicas y rápidamente disponibles resultan muy deseables y beneficiarán a los pacientes. Un instrumento que pueda usar una cámara de análisis desechable, uno que puede funcionar sin fluidos internos aparte del flujo capilar (es decir, uno que pueda funcionar independientemente de la gravedad y orientación) , y uno que se pueda utilizar como dispositivo portátil serían de gran beneficio.

Sumario de la invención

Según un primer y amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un método para determinar el hematocrito de una muestra de sangre según la reivindicación 1. La muestra de sangre puede ser una muestra de sangre sustancialmente no diluida. La altura de dicha cámara es tal que al menos algunas de las RBC dentro de la muestra, o bien individualmente o en forma de agregado, están en contacto con ambas superficies interiores de los paneles o bien individualmente o en forma de agregado.

Según un segundo y amplio aspecto de la invención, se proporciona un aparato para determinar el hematocrito de una muestra de sangre sustancialmente diluida que se encuentra de forma quiescente dentro de una cámara de análisis, según la reivindicación 11. La altura de la cámara es tal que al menos algunas de las RBC dentro de la muestra individualmente o en forma de agregado, están en contacto con ambas superficies interiores o bien individualmente o en forma de agregado.

Una ventaja de la presente invención es que se puede usar para determinar un valor de hematocrito utilizando un volumen de muestra extremadamente pequeño que se puede obtener directamente del paciente mediante una perforación de un capilar, lo que lo hace más útil desde el punto de vista de una aplicación cuidadosa o de una muestra de sangre venosa, si se desea.

Otra ventaja de la presente invención es que se puede determinar un valor de hematocrito independientemente del conocimiento del factor de aumento del instrumento (tamaño de la imagen/unidad... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el hematocrito de una muestra de sangre que comprende las etapas de:

depositar la muestra en una cámara de análisis (10) adaptada para contener en forma quiescente la muestra para su análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12) , y una superficie interior (18) de un segundo panel (16) , en la que ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , siendo dicha altura tal que al menos algunas células sanguíneas rojas dentro de la muestra están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , y una o más zonas vacías de células rojas dentro de la muestra quiescente se extienden entre la superficies interiores (14, 18) ,

captar imágenes de al menos una parte de la muestra quiescente, la cual contiene las células sanguíneas rojas y una o más zonas vacías de células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) , para determinar un valor de densidad óptica de la parte de la muestra de la que se han captado las imágenes con un criterio por unidad de imagen,

seleccionar y calcular los valores medios de los valores de densidad óptica de las unidades de imagen ópticamente alineadas con las células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) y, asignar un valor límite superior de 100% a valor medio de densidad óptica de esas unidades de imagen;

seleccionar y calcular el valor medio de los valores de densidad óptica de las unidades de imagen ópticamente alineadas con una o más zonas vacías de las células sanguíneas rojas, y asignar una valor límite inferior de 0% a los valores de densidad óptica de esas unidades de imagen; y

determinar el hematocrito de la muestra asignando valores relativos al valor de densidad óptica de cada unidad de imagen de la parte de la muestra de la que se captan imágenes, en función de los valores límites superior e inferior, y calculando el valor medio de los valores relativos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que al menos algunas células sanguíneas rojas dentro de la muestra que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) incluyen células sanguíneas rojas que están en contacto de forma individual con las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) .

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar al menos una parte de la muestra con un agente agregante.

4. El método de la reivindicación 3, en el que al menos algunas células sanguíneas rojas dentro de la muestra que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) incluyen células sanguíneas rojas agregadas, cuyos agregados están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) .

5. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de captar imágenes de al menos una parte de la muestra quiescente incluye transmitir la luz de una o más longitudes de onda predeterminadas a través de la muestra y capturar la luz transmitirá después de que ha pasado a través de dicha muestra, en el que los valores de densidad óptica están relacionados con la luz transmitida y que ha pasado a través de la muestra.

6. El método de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de mezclar al menos una parte de la muestra con una agente de formación de esferas isovolumétricas.

7. El método de la reivindicación 1, en el que se obtienen imágenes de toda la muestra.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de seleccionar y calcular el valor medio de los valores de densidad óptica de los píxeles ópticamente alineados con las células sanguíneas rojas que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , comprende además la etapa de determinar un valor medio de densidad óptica máxima de al menos una parte de las células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) , y determinar una desviación estándar de la densidad óptica entre al menos una parte de las células sanguíneas rojas, y usar el valor medio de densidad óptica máxima como el valor medio de densidad óptica de los píxeles que están ópticamente alineados con las células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) , cuando la desviación estándar es igual o inferior a un valor predeterminado.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la etapa de determinar el valor medio de densidad óptica máxima de al menos una parte de las células sanguíneas rojas que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) se realiza de manera iterativa con diferentes grupos de células sanguíneas rojas que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , hasta que la desviación estándar del valor medio de densidad óptica máxima sea igual

o inferior al valor predeterminado.

10. El método de la reivindicación 9, en el que las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) son sustancialmente paralelas, y la altura está dentro del intervalo de aproximadamente dos micrómetros a seis micrómetros.

11. Un aparato para determinar el hematocrito de una muestra de sangre que está en forma quiescente dentro de una cámara de análisis (10) , estando dicha cámara (10) definida por un par de paneles transparentes (12, 16) y que tiene un altura que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , siendo dicha altura tal que al menos algunas células sanguíneas rojas dentro de la muestra están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , y una o más zonas vacías de células sanguíneas rojas dentro de la muestra quiescente se extienden entre las superficies interiores (14, 18) , comprendiendo el aparato;

una unidad de captación de imágenes que incluye un iluminador (46) y un disector de imágenes (48) , y dicha unidad es operable para captar imágenes de al menos una parte de la muestra que está en forma quiescente dentro de la cámara (10) que contiene las células sanguíneas rojas y una o más zonas vacías de células sanguíneas rojas que están en contacto con la superficies interiores (14, 18) , y producir señales de imágenes representativas de dicha parte de la muestra de la que se ha obtenido la imagen; y

un analizador programable (50) adaptado para determinar, usando las señales de imagen, los valores de densidad óptica de la parte de la muestra de la que se ha obtenido la imagen con un criterio por píxel, y seleccionar y calcular el valor medio de los valores de densidad óptica de los píxeles ópticamente alineados con las células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) , y asignar un valor límite superior de 100% al valor medio de densidad óptica de esos píxeles, y seleccionar los valores de densidad óptica de los píxeles ópticamente alineados con una o más zonas vacías de células sanguíneas rojas y asignar un valor límite inferior de 0% a los valores de densidad óptica de esos píxeles, y determinar el hematocrito de la muestra asignando valores relativos al valor de densidad óptica de cada píxel de la parte de la muestra de la que se han obtenido las imágenes, en función de los valores límites superior e inferior, y calcular el valor medio de los valores relativos.

12. El aparato de la reivindicación 11, que comprende además:

Una cámara de análisis (10) adaptada a mantener en forma quiescente la muestra para el análisis, estando la cámara (10) definida por una superficie interior (14) de un primer panel (12) , y por una superficie interior (18) de un segundo panel (16) , en la que ambos paneles (12, 16) son transparentes, y la cámara (10) tiene una altura que se extiende entre las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) , siendo dicha altura tal que al menos algunas células sanguíneas rojas dentro de la muestra están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) y una o más zonas vacías de células sanguíneas rojas dentro de la muestra quiescente se extienden entre las superficies interiores (14, 18) .

13. El aparato de la reivindicación 12, en el que el analizador programable está adaptado para controlar la unidad de captación de imágenes para obtener imágenes de la cámara de análisis (10) .

14. El aparato de la reivindicación 12, en el que el analizador programable (50) , adaptado para seleccionar y calcular el valor medio de los valores de densidad óptica de los píxeles, se adapta además para determinar un valor medio de densidad óptica máxima de al menos una parte de las células sanguíneas rojas que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , y para determinar una desviación estándar de la densidad óptica dentro de al menos una parte de las células sanguíneas rojas, y para usar el valor medio de densidad óptica máxima como el valor medio de la densidad óptica de los píxeles que están ópticamente alineados con las células sanguíneas rojas que están en contacto con las superficies interiores (14, 18) , cuando la desviación estándar es igual o inferior a un valor predeterminado.

15. El aparato de la reivindicación 14, en el que el analizador programable (50) adaptado para determinar el valro medio de densidad óptica máxima de al menos una parte de las células sanguíneas rojas, es adaptado adicionalmente para realizar de manera iterativa dicha determinación con diferentes grupos de las células sanguíneas rojas que están en contacto con ambas superficies interiores (14, 18) , hasta que la desviación estándar del valor medio de densidad óptica máxima sea igual o inferior a un valor predeterminado.

16. El aparato de la reivindicación 12, en el que el las superficies interiores (14, 18) de los paneles (12, 16) son sustancialmente paralelas, y la altura está dentro del intervalo de aproximadamente dos micrómetros a seis micrómetros.

FIG. 9

Calcular los valores medios de densidad óptica de unidades de imagen ópticamente alineadas con células sanguíneas rojas y/o agregados que están en contacto con los paneles de la cámara y asignar un valor límite superior a esas unidades de imagen

Determinar el hematocrito asignando valores de densidad óptica relativa a cada unidad de imagen alineada con la muestra en función de los valores de límites superior e inferior y calcular el valor medio de los valores relativos