Determinación de grupos sanguíneos.

Procedimiento de análisis de sangre para su utilización en la detección de una enfermedad en el que al menos unanticuerpo y/o factor de complemento característicos se unen a los glóbulos rojos del paciente,

cuyo procedimientoque comprende las etapas consistentes en:

- proporcionar un bio chip en el que diversos agentes de unión que son capaces de unirse específicamente adiferentes anticuerpos o factores del complemento característicos están inmovilizados sobre un sustrato enposiciones diferenciadas predefinidas;

- poner en contacto una muestra de sangre del paciente con dicho bio chip;

- eliminar algunos glóbulos rojos no unidos de al menos una zona de dicho sustrato en la que dichos agentes deunión están inmovilizados; y

- detectar la presencia de glóbulos rojos unidos mediante dichos anticuerpos característicos a dicho bio chip, a finde determinar la presencia de cualquiera de dichos anticuerpos y/o factor de complemento característicos unidoa los glóbulos rojos del paciente.

Determinación de grupos sanguíneos

La presente invención se refiere a la determinación de grupos sanguíneos y más específicamente a la detección de fenotipos específicos, caracterizados por anticuerpos específicos presentes en la superficie de los eritrocitos.

La prueba directa de Coombs (también conocida como prueba directa de antiglobulina o DAT o DAGT) se utiliza para detectar si los anticuerpos o los factores complementarios del sistema se han unido a antígenos en la superficie de eritrocitos o glóbulos rojos (RBC) in vivo. Dichos anticuerpos unidos están asociados a diversas enfermedades en las que un mecanismo inmunitario está atacando a los propios eritrocitos del paciente. Este mecanismo podría ser aloinmunidad, autoinmunidad o un mecanismo inmunomediado provocado por fármacos. Con más detalle dichas enfermedades comprenden:

Ejemplos de hemólisis aloinmunitaria

Enfermedad hemolítica del recién nacido (también conocida como EHRN o eritroblastosis fetal)

Enfermedad hemolítica por Rhesus D del recién nacido (también conocida como enfermedad de Rh)

Enfermedad hemolítica ABO del recién nacido (la prueba indirecta de Coombs puede ser sólo muy poco

positiva)

Enfermedad hemolítica anti-Kell del recién nacido

Enfermedad hemolítica por Rhesus C del recién nacido

Otro incompatibilidad de grupos sanguíneos (RhC, Rhe, RhE, Kid, Duffy, MN, P y otros)

Reacciones a la transfusión hemolítica aloinmunitaria

Ejemplos de hemólisis autoinmunitaria

Anemia autoinmunohemolítica por anticuerpos calientes

Idiopáticas

Lupus eritematoso diseminado

Síndrome de Evans (anticuerpos antiplaquetarios y anticuerpos hemolíticos)

Anemia autoinmunohemolítica por crioanticuerpos

Síndrome idiopático de criohemaglutinina

Mononucleosis infecciosa

Criohemoglobinuria paroxística (rara)

Hemólisis inmunomediada provocada por fármacos

Metildopa

Penicilina (dosis alta)

El sistema complementario se compone de una serie de pequeñas proteínas encontradas en la sangre, que cooperan con la interacción antígeno-anticuerpo para matar células diana. Más de 20 proteínas y fragmentos de proteínas conforman el sistema complementario.

Convencionalmente la prueba DAT se ha realizado como prueba de aglutinación en un tubo de ensayo. Más recientemente esta prueba también se ha realizado utilizando tecnología de microplacas y gel de aglutinación. La prueba sin embargo, todavía es algo engorrosa y la lectura automatizada de los resultados puede ser problemática.

Más recientemente se ha encontrado que la determinación de grupos sanguíneos ABO puede realizarse correctamente utilizando bio chips de proteínas no aglutinantes, en los que un anticuerpo inmovilizado se une a un antígeno en la superficie del RBC y se detecta la presencia de los RBC así inmovilizados (J. S. Robb et al. 2006) . Se ha encontrado además que la tecnología de bio chips de anticuerpos puede utilizarse para eritrocitos de fenotipo mediante la detección de mezclas complejas de antígenos en las superficies celulares (C. J. Campbell et al. 2006) . Los antígenos son tanto los antígenos de azúcar, que tienden a ser bien presentados y fácilmente accesibles como los antígenos de péptidos, que son epítopos de proteínas transmembranarias y por lo tanto, sepultados y sujetados más fijamente a la superficie de la célula y éstos se lograron diferenciar utilizando la elección correcta de anticuerpos.

La memoria de patente CA2, 365.178 da a conocer un bio chip con una variedad de sitios que contiene cada uno un reactivo. El reactivo es generalmente un anticuerpo. El objetivo es identificar anticuerpos en el suero o plasma de la sangre; o para detectar antígenos de superficie celular integral presentes, por ejemplo, en la superficie de los glóbulos rojos.

El documento WO 2006/100477 (un documento intermedio a tenor del artículo 54 (3) EPC) da a conocer un procedimiento para la determinación de un grupo sanguíneo de una muestra utilizando un sustrato con uno o más agentes de unión allí unidos a éste capaces de unir antígenos específicos del grupo RBC.

Los inventores han descubierto ahora sorprendentemente que los RBC recubiertos con anticuerpos o complemento (proteína) puede soportar el tratamiento requerido y permanecer "sensibilizados" (recubiertos) con dicho anticuerpo

o complemento unido a dichos RBC, y que la tecnología de bio chips puede utilizarse para detectar anticuerpos y/o complemento presente en la superficie de los RBC, proporcionando de este modo una prueba que es mucho más eficaz y una alternativa eficaz a las pruebas convencionales de DAT, y que puede, además, integrarse fácilmente en

un único bio chip con otras pruebas importantes en el tratamiento de la sangre - incluyendo la determinación de grupos sanguíneos de varios antígenos en la superficie de los RBC.

Así en un primer aspecto de la presente invención se proporciona, un procedimiento de análisis de sangre adecuado para utilización en la detección de una enfermedad en la que al menos un anticuerpo y/o el factor del complemento característicos se unen a los glóbulos rojos de pacientes, cuyo procedimiento comprende las etapas consistentes en:

- proporcionar un bio chip en el que una variedad de agentes de unión que son capaces de unir específicamente a diferentes anticuerpos o factores del complemento característicos se inmovilizan sobre un sustrato en posiciones diferenciadas predefinidas;

- poner en contacto una muestra de sangre del paciente con dicho bio chip;

- eliminar algunos glóbulos rojos no unidos de al menos una zona de dicho sustrato en el que dichos agentes de unión están inmovilizados; y

- detectar la presencia de glóbulos rojos unidos mediante dichos anticuerpos característicos a dicho bio chip, para determinar la presencia de cualquiera de dichos anticuerpos característicos y/o del factor de complemento unidos a los glóbulos rojos del paciente.

Mientras que la utilización de bio chips de proteínas para anticuerpos de unión se ha conocido anteriormente, es muy sorprendente que los RBC unidos por los anticuerpos característicos, puede sobrevivir al tratamiento adicional necesario para la detección de dichos RBC y permanecer unidos a éstos y de este modo mantenidos secuestrados a los bio chips. El tratamiento adicional conlleva el lavado de los bio chips para retirar la materia no ligada y reducir la unión inespecífica, además del secado para permitir que se lleva a cabo la exploración.

La presente invención además describe un bio chip de proteína para su utilización en la detección de una enfermedad en la que un mecanismo inmune está atacando a los propios RBC del paciente y se caracteriza por al menos un anticuerpo o factor de complemento característico unido a dichos RBC, cuyo bio chip de proteína ha inmovilizó sobre un sustrato en posiciones diferenciadas predefinidas, una variedad de agentes de unión que pueden unir específicamente a dichos anticuerpos característicos/factor de complemento diferentes.

La nueva forma de pruebas DAGT de la presente invención con múltiples sondas diferenciadas en un sistema de una sola prueba y al mismo tiempo, que facilita la combinación de grupos sanguíneos, fenotipado y DAGT, mejorará la eficiencia y la eficacia de los procedimientos de análisis de sangre, permitiendo la identificación y la diferenciación de los diferentes recubrimientos de DAGT de diferentes anticuerpos y/o factores del complemento característicos. Esto minimizará también retrasos en la determinación de la significación clínica del recubrimiento de DAGT.

En general agentes de unión adecuados comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpo específicos para los anticuerpos o factores del complemento característicos que se han de detectar. Sin embargo, pueden emplearse otros agentes de unión específicamente reactivos, tales como pequeñas moléculas de anticuerpos miméticos, ligandos de ácido nucleico o receptores de otras células que pueden unir dichos antígenos. Sin embargo,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de análisis de sangre para su utilización en la detección de una enfermedad en el que al menos un anticuerpo y/o factor de complemento característicos se unen a los glóbulos rojos del paciente, cuyo procedimiento que comprende las etapas consistentes en:

- proporcionar un bio chip en el que diversos agentes de unión que son capaces de unirse específicamente a diferentes anticuerpos o factores del complemento característicos están inmovilizados sobre un sustrato en posiciones diferenciadas predefinidas;

- poner en contacto una muestra de sangre del paciente con dicho bio chip;

- eliminar algunos glóbulos rojos no unidos de al menos una zona de dicho sustrato en la que dichos agentes de unión están inmovilizados; y

- detectar la presencia de glóbulos rojos unidos mediante dichos anticuerpos característicos a dicho bio chip, a fin de determinar la presencia de cualquiera de dichos anticuerpos y/o factor de complemento característicos unido a los glóbulos rojos del paciente.

2. Procedimiento según la reivindicación anterior en el que el agente de unión es un anticuerpo monoclonal.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el agente de unión es un anticuerpo policlonal.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el agente de unión es un anticuerpo quimérico.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el agente de unión es un anticuerpo monocatenario.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 en el que el agente de unión está seleccionado entre un anti-IgG1 monoclonal, anti-IgG3 monoclonal y anti-C3 monoclonal.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 en el que se incluye agente de unión anti-IgG policlonal.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que al menos dos agentes de unión diferentes están inmovilizados en zonas diferenciadas del sustrato.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que cada agente de unión está proporcionado en un determinado número de diluciones diferentes.

10. Procedimiento según la reivindicación 9 en en el que cada agente de unión se repite un determinado número de veces a una dilución dada.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el sustrato es de vidrio, silicio, óxido de silicio, metales y óxidos metálicos; ya sea sin polímero funcional o funcionalizado con el mismo.

12. Procedimiento según reivindicación 11 en el que el sustrato es un sustrato recubierto de oro.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en en el que el oro está funcionalizado de manera que los agentes de unión pueden ser inmovilizados en el mismo.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la funcionalización es tal que puede controlarse la distancia entre la superficie de oro y un glóbulo rojo unido.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el bio chip se forma sobre una superficie plana o esferoidal.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato es un soporte rígido o semirrígido incluyendo membranas, filtro, bio chips, portaobjetos, obleas, fibras, perlas magnéticas o no magnéticas, geles, tubuladura, placas, polímeros, micropartículas y capilares.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de unión está inmovilizado en puntos de menos de 1 mm de diámetro.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el sustrato comprende una pluralidad de bio chips separados en el superficie del sustrato, dispuestos de manera que permita poner en contacto muestras separadas con cada biobio chip de tal manera de que las muestras no se mezclen.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las zonas del sustrato no provistas de agente de unión se tratan con agentes de bloqueo a fin de minimizar cualquier unión no específica.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los glóbulos rojos unidos se detectan por detección secundaria por marcaje.