Degradación de plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos.

Un método para eliminar o reducir la concentración de un piretroide en una muestra,

comprendiendo el métodoponer en contacto la muestra con α-carboxilesterasa de díptero, o un mutante de la misma, en el que la α-carboxilesterasa de díptero, o un mutante de la misma, comprende una secuencia seleccionada del grupo queconsiste en:

i) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1,

ii) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 2, y

iii) una secuencia que es al menos 80% idéntica a i) o ii) que es capaz de hidrolizar un piretroide.

Degradación de plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos

Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos para degradar plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos. En particular, la presente invención se refiere al uso de esterasas insecticidas, tales como a-carboxilesterasas, y sus mutantes, en el biorremedio de residuos de piretroides que contaminan el medioambiente y productos básicos de consumo hortícolas.

Antecedentes de la invención

Los piretroides constituyen una clase importante de plaguicidas químicos. Son análogos sintéticos de las piretrinas naturales, que son producidas en las flores de la planta de piretro (Tanacetum cinerariifolium) . La modificación de su estructura ha producido compuestos que retienen la toxicidad intrínsecamente modesta para vertebrados de los productos naturales, pero son más estables y más potentes como plaguicidas. En los años treinta desde su introducción han escalado hasta alrededor de 10-20% de las ventas de insecticidas a nivel mundial, y se proyecta que retengan una cuota de mercado sustancial en el futuro previsible. Ahora se usan ampliamente por sistemas de producción y procesamiento agrícolas en muchos países, y han provocado incidentes debido a los residuos en diversos artículos de consumo que van desde el algodón y la horticultura hasta la madera.

Los residuos de plaguicidas de piretroides son contaminantes indeseables del medioambiente y un abanico de artículos de consumo. Son indeseables debido al amplio intervalo de dianas del plaguicida en los invertebrados y su toxicidad significativa para vertebrados, aunque generalmente se considera que están entre los plaguicidas más seguros para los mamíferos. Las áreas de sensibilidad particular incluyen la contaminación del suelo, agua embalsada de irrigación que se recicla, usada por regantes aguas abajo o que simplemente se recoge desde un área de captación de agua sin cosechar y se desvía al área cosechada con fines de irrigación, y residuos por encima de los niveles permisibles en las exportaciones hortícolas. Las industrias de animales también tienen problemas con artículos de consumo contaminados con plaguicidas, que surgen bien a través de su propio uso de plaguicidas o bien su confianza en productos y subproductos de cosechas tal como forraje. Las aguas del procesamiento procedentes de plantas de procesamiento de alimentos, baños de tinte para alfombras y baños de animales también son contaminados, algunas veces de forma bastante excesiva, con residuos de plaguicidas. Por lo tanto, se requieren estrategias de biorremediación para eliminar o reducir estos residuos de plaguicidas.

Una estrategia de biorremediación propuesta implica el uso de enzimas capaces de inmovilizar o degradar los residuos de plaguicida. Tales enzimas se pueden emplear, por ejemplo, en biorreactores a través de los cuales se podría hacer pasar agua contaminada, o en disoluciones de lavado después de la desinfestación tras la cosecha de frutas, vegetales o productos de animales, para reducir los niveles de residuos y los tiempos de espera. Las enzimas adecuadas para degradar residuos de plaguicidas incluyen OP hidrolasas de bacterias, vertebrados e insectos resistentes a organofosfatos (OP) . Es deseable que las enzimas hidrolíticas degraden los residuos de plaguicidas a una velocidad rápida.

La resistencia a organofosfatos en la moscarda carroñera, Lucilia cuprina, es conferida por dos mutaciones diferentes en el gen que codifica carboxilesterasa E3. Las dos enzimas mutantes difieren en sus especificidades por el sustrato, pero entre ellas pueden destoxificar dos subtipos principales de OPs. El gen E3 de L. cuprina fue clonado por Newcomb et al. (1997) , y, usando una combinación de secuenciación de ADN, expresión de baculovirus y mutagénesis in vitro, estos investigadores identificaron las dos mutaciones de la resistencia. Una es una sustitución de Asp por Gly en el resto 137 en la región del agujero de oxoanión del sitio activo (Newcomb et al., 1997) . La otra es una sustitución de Leu por Trp en el resto 251 en la región de unión al sustrato (Campbell et al., 1998) , que da como resultado un incremento en la actividad de malatión carboxilesterasa, así como la adquisición de actividad de OP hidrolasa.

Existe la necesidad de métodos y enzimas que se pueden usar para la biorremediación de, por ejemplo, suelos, productos alimentarios y muestras de agua contaminados con plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos.

Sumario de la invención

Se ha encontrado ahora que las esterasas de insecto, y mutantes de las mismas, son capaces de hidrolizar plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos tales como piretroides. La actividad de las esterasas de insecto, y mutantes de las mismas, muestran un grado de especificidad quiral, que difiere entre mutantes. Por lo tanto, es posible proporcionar un juego de esterasas de insecto, o mutantes de las mismas, que son capaces de degradar plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos que pueden actuar, solas o juntas, como agentes de biorremediación eficaces para plaguicidas y toxinas de ésteres hidrófobos tales como piretroides.

En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para eliminar o reducir la concentración de un piretroide en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con una esterasa de insecto, o un mutante de la misma, en el que la esterasa de insecto es una a-carboxilesterasa, que se puede aislar de la especie de Diptera. Las enzimas específicas que se encuentran en esta subclave incluyen, pero no se limitan a, las esterasas E3 o EST23.

En consecuencia, las a-carboxilesterasas para uso en la presente invención son la E3 esterasa (SEC ID NO: 1) , que deriva de Lucilia cuprina, o la EST23 esterasa (SEC ID NO: 2) , que deriva de Drosophila melanogaster, o una secuencia que es al menos 80% idéntica a SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2.

En una realización preferida adicional, la esterasa mutante de insecto tiene una mutación o mutaciones en las regiones del agujero de oxoanión, del bolsillo de unión a acilo o del sitio aniónico del sitio activo, o cualquier combinación de las mismas.

En una realización preferida adicional, la a-carboxilesterasa mutante se selecciona del grupo que consiste en: E3G137R, E3G137H, E3W251L, E3W251S, E3W251G, E3W251T, E3W251A, E3W251L/F309L, E3W251L/G137D, E3W251L/P250S, E3F309L, E3Y148F, E3E217M, E3F354W, E3F354L, y EST23W251L. Preferiblemente, la acarboxilesterasa mutante es E3W251L, E3F309L, E3W251L/F309L o EST23W251L.

En el primer aspecto, la a-carboxilesterasa, o un mutante de la misma, tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

i) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1,

ii) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 2, y

iii) una secuencia que es al menos 80% idéntica a i) o ii) que es capaz de hidrolizar un piretroide. Más preferiblemente, el polipéptido es al menos 90% idéntico, más preferiblemente al menos 95% idéntico, e incluso más preferiblemente al menos 97% idéntico a i) o ii) .

Como sabrá el destinatario experto, el método del primer aspecto se puede llevar a cabo usando más de una esterasa de insecto, o mutantes de la misma. Este es particularmente el caso cuando diferentes esterasas de insecto, o mutantes de las mismas, tienen diferente actividad hidrolítica para diferentes estereoisómeros del piretroide.

El piretroide puede ser un piretroide de tipo I o tipo II. Preferiblemente, el piretroide de tipo I se selecciona del grupo que consiste en: 1S/1R trans permetrina, 1S/1R cis permetrina, NRDC157 1S cis, y NRDC157 1R cis. Preferiblemente, el piretroide de tipo II es deltametrina.

Preferiblemente, la muestra es una muestra de suelo, una muestra de agua o una muestra biológica. Las muestras biológicas preferidas incluyen materia derivada de plantas, tales como semillas, vegetales o frutas, así como materia derivada de animales, tal como carne.

Preferiblemente, el método se lleva a cabo en un entorno que contiene líquido.

La muestra se puede exponer a la esterasa de insecto, o un mutante de la misma, por cualquier medio apropiado. Esto incluye proporcionar la esterasa de insecto, o mutante de la misma, directamente a la muestra, con o sin vehículos o excipientes, etc. La esterasa de insecto, o mutante de la misma, también se puede proporcionar en forma de una célula hospedante,... [Seguir leyendo]

1. Un método para eliminar o reducir la concentración de un piretroide en una muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con a-carboxilesterasa de díptero, o un mutante de la misma, en el que la acarboxilesterasa de díptero, o un mutante de la misma, comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

i) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1,

ii) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 2, y

iii) una secuencia que es al menos 80% idéntica a i) o ii) que es capaz de hidrolizar un piretroide.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia es al menos 90% idéntica a i) o ii) .

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la a-carboxilesterasa mutante de díptero tiene una mutación o mutaciones en las regiones del agujero de oxoanión, del bolsillo de unión a acilo o del sitio aniónico de un sitio activo de la esterasa, o cualquier combinación de las mismas.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la a-carboxilesterasa mutante de díptero comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la glicina en el resto de aminoácido número 137 se sustituye por una arginina o una histidina,

ii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, serina, glicina, treonina, o alanina,

iii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, y la fenilalanina en el resto de aminoácido número 309 se sustituye por una leucina,

iv) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, y la glicina en el resto de aminoácido número 137 se sustituye por un ácido aspártico,

v) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, y la prolina en el resto de aminoácido número 250 se sustituye por una serina,

vi) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la fenilalanina en el número de aminoácido 309 se sustituye por una leucina,

vii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la tirosina en el número de aminoácido 148 se sustituye por una fenilalanina,

viii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el ácido glutámico en el número de aminoácido 217 se sustituye por una metionina,

ix) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la fenilalanina en el número de aminoácido 354 se sustituye por un triptófano, o una leucina, y

x) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 2, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el método se lleva a cabo usando dos o más a-carboxilesterasas de díptero, o mutantes de las mismas.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el piretroide es un piretroide de Tipo I o Tipo II.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el piretroide de Tipo I se selecciona del grupo que consiste en: 1S/1R trans permetrina, 1S/1R cis permetrina, NRDC157 1S cis, y NRDC157 1R cis.

8. El método de la reivindicación 6, en el que el piretroide de Tipo II es deltametrina.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el método se lleva a cabo en un entorno que contiene líquido.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la a-carboxilesterasa de díptero, o mutante de la misma, se proporciona directamente a la muestra.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la a-carboxilesterasa de díptero, o mutante de la misma, se proporciona a la muestra mediante expresión de un polinucleótido que codifica la acarboxilesterasa de díptero, o mutante de la misma, a partir de una célula hospedante que comprende el polinucleótido.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la a-carboxilesterasa de díptero, o mutante de la misma, se proporciona como una esponja polimérica o espuma, comprendiendo la espuma o esponja la a-carboxilesterasa de díptero, o mutante de la misma, inmovilizada sobre un soporte poroso polimérico.

13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el método comprende además la presencia de un tensioactivo cuando el piretroide se pone en contacto con la a-carboxilesterasa de díptero, o mutante de la misma.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el tensioactivo es un biotensioactivo.

15. Un método para seleccionar una enzima que hidroliza un piretroide, comprendiendo el método

(a) introducir una o más mutaciones en una a-carboxilesterasa de díptero, o una a-carboxilesterasa de díptero que ya se ha mutado, y

(b) determinar la capacidad de la a-carboxilesterasa de díptero mutante para hidrolizar un piretroide, en el que la a-carboxilesterasa de díptero, o un mutante de la misma, comprende una secuencia seleccionada del

grupo que consiste en: i) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, ii) una secuencia como se muestra en SEC ID NO: 2, y iii) una secuencia que es al menos 80% idéntica a i) o ii) .

16. El método de la reivindicación 15, en el que la secuencia es al menos 90% idéntica a i) o ii) .

17. El método de la reivindicación 15 o de la reivindicación 16, en el que la una o más mutaciones mejora la actividad hidrolítica y/o altera la estereoespecificidad de la esterasa.

18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en el que la una o más mutaciones están en una región de la esterasa seleccionada del grupo que consiste en: agujero de oxoanión, bolsillo de unión a acilo, y sitio aniónico.

19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que la mutación es una mutación de punto.

20. El método de la reivindicación 15, en el que la a-carboxilesterasa de díptero que ya se ha mutado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

i) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la glicina en el resto de aminoácido número 137 se sustituye por una arginina o una histidina,

ii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, serina, glicina, treonina, o alanina,

iii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, y la fenilalanina en el resto de aminoácido número 309 se sustituye por una leucina,

iv) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, y la glicina en el resto de aminoácido número 137 se sustituye por un ácido aspártico,

v) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina, y la prolina en el resto de aminoácido número 250 se sustituye por una serina,

vi) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la fenilalanina en el número de aminoácido 309 se sustituye por una leucina,

vii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la tirosina en el número de aminoácido 148 se sustituye por una fenilalanina,

viii) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que el ácido glutámico en el número de aminoácido 217 se sustituye por una metionina,

ix) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 1, en la que la fenilalanina en el número de aminoácido 354 se sustituye por un triptófano, o una leucina, y

x) la secuencia como se muestra en SEC ID NO: 2, en la que el triptófano en el resto de aminoácido número 251 se sustituye por una leucina.