CLON GENÓMICO DE NICOTINA DESMETILASA DE TABACO Y USOS DEL MISMO.

Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una nicotina desmetilasa,

comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico (a) la secuencia de SEQ ID NO:1, o (b) al menos 200 pares de bases consecutivas idénticas a 200 pares de bases consecutivas de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7

Clon genómico de nicotina desmetilasa de tabaco y usos del mismo La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican para nicotina desmetilasa y a métodos para usar esas secuencias de ácido nucleico para alterar fenotipos vegetales.

Antecedentes El citocromo p450 cataliza reacciones enzimáticas para una gama diversa de sustratos químicamente distintos que incluyen el metabolismo oxidativo, peroxidativo y reductor de sustratos xenobióticos y endógenos. En plantas, p450 participa en rutas bioquímicas que incluyen la síntesis de productos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glicósidos cianogénicos y glucosilonatos (Chappell, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 521-547, 1995) . El citocromo p450s, también conocido como proteínas hemo-tiolato p450, actúa habitualmente como oxidasas terminales en cadenas de transferencia de electrones de múltiples componentes, denominadas sistemas de monooxigenasas que contienen p450. Las reacciones específicas catalizadas por estos sistemas enzimáticos incluyen desmetilación, hidroxilación, epoxidación, N-oxidación, sulfooxidación, N-, S- y Odesalquilaciones, desulfatación, desaminación y reducción de grupos N-óxido, nitro y azo.

El papel diverso de las enzimas p450 de la planta Nicotiana se ha implicado en la generación de una variedad de metabolitos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lípidos, glicósidos cianogénicos, glucosilonatos y una gran cantidad de otras entidades químicas. Algunas enzimas p450 pueden tener un impacto sobre la composición de metabolitos vegetales. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y aroma de ciertas plantas alterando el perfil de una planta de ácidos grasos seleccionados a través de cultivo; sin embargo, se conoce muy poco sobre los mecanismos implicados en el control de los niveles de estos constituyentes de la hoja. La regulación por disminución o regulación por incremento de enzimas p450 asociadas con la modificación de los ácidos grasos puede facilitar la acumulación de ácidos grasos deseados que proporcionan cualidades fenotípicas más preferidas de la hoja.

La función de las enzimas p450 y sus papeles crecientes en constituyentes vegetales están descubriéndose aún. Por ejemplo, se encontró que una clase especial de enzimas p450 catalizaba la descomposición de ácido graso en 1-alcoholes y aldehídos C6 y C9 volátiles que son contribuyentes principales del olor “verde fresco” de frutas y verduras. El nivel de otras p450 seleccionadas como diana novedosas puede alterarse para potenciar las cualidades de los constituyentes de la hoja modificando la composición lipídica y metabolitos de descomposición relacionados en la hoja de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la hoja se ven afectados por la senescencia que estimula la maduración de propiedades de calidad de la hoja. Todavía otros informes han mostrado que las enzimas p450 desempeñan un papel funcional en la alteración de ácidos grasos que están implicados en la resistencia a enfermedad e interacciones planta-patógeno.

En otros ejemplos, se ha sugerido que las enzimas p450 están implicadas en la biosíntesis de alcaloides. Tal como se proporciona en las solicitudes de patente por el solicitante, de las que la presente solicitud reivindica prioridad, la nornicotina, un alcaloide minoritario encontrado en Nicotiana tabacum, se produce mediante la desmetilación mediada por p450 de nicotina seguida por acilación y nitrosación en la posición N produciendo de ese modo una serie de N-acilnonicotinas y N-nitrosonomicotinas. Se cree que la N-desmetilación, catalizada por una p450 desmetilasa, es una fuente primaria de biosíntesis de nornicotina en Nicotiana.

Existe una necesidad en la técnica de reactivos y métodos para modificar fenotipos vegetales. En particular, existe una necesidad de reactivos y métodos para modificar la nicotina desmetilasa. La presente invención proporciona varias estrategias para modificar la expresión de una nicotina desmetilasa.

Sumario de la invención Los presentes inventores han identificado y caracterizado un clon genómico de la nicotina desmetilasa a partir de tabaco. Se incluyen en el presente documento secuencias para la región codificante de la proteína nicotina desmetilasa, la región no traducida en 3' (“UTR en 3'”) , un intrón individual y el promotor del gen de nicotina desmetilasa junto con sus secuencias reguladoras de la transcripción (figura 1) . Se describe además el uso de estas secuencias para crear plantas transgénicas que tienen niveles alterados de nornicotina o N'-nitrosonomicotina (“NNN”) o ambos con respecto a una planta control.

Por consiguiente, la invención describe una molécula de ácido nucleico aislada, una planta de tabaco transgénica, un componente vegetal de la planta de tabaco, un producto de tabaco, una semilla de la planta de tabaco, una nicotina desmetilasa de tabaco recombinante y diversos métodos que implican lo mismo, tal como se define en las reivindicaciones.

Por consiguiente, en el primer aspecto, la descripción describe una molécula de ácido nucleico aislada, por ejemplo, una secuencia de ADN, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una nicotina desmetilasa. En realizaciones deseables, la secuencia de nucleótidos del primer aspecto es sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica para una nicotina desmetilasa de tabaco, tal como una nicotina desmetilasa de tabaco que contiene una secuencia de nucleótidos que es al menos el 70% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o que contiene los nucleótidos 2010-2949 y/o 3947-4562 de SEQ ID NO: 1, o que contiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3. La molécula de ácido nucleico aislada del primer aspecto de la descripción, por ejemplo, está operativamente unida a un promotor funcional en una célula vegetal y deseablemente está contenida en un vector de expresión. En otras realizaciones deseables, el vector de expresión está contenido en una célula, por ejemplo, una célula vegetal. Deseablemente, la célula vegetal, tal como una célula vegetal de tabaco, está incluida en una planta. En otra realización deseable, la descripción describe una semilla, por ejemplo, una semilla de tabaco, a partir de una planta que contiene el vector de expresión, en la que la semilla incluye una molécula de ácido nucleico aislada que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO:3 operativamente unida a una secuencia promotora heteróloga. Además, la descripción describe una planta derivada de una semilla germinada que contiene el vector de expresión, una hoja, o bien verde o bien curada, de la planta, y un artículo de fabricación preparado a partir de la hoja.

En otra realización deseable, la secuencia de nucleótidos contiene una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con el complemento de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:3, o a un fragmento de SEQ ID NO:1 I o SEQ ID NO:3. Deseablemente, la secuencia de nucleótidos codifica para una nicotina desmetilasa que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En una realización deseable adicional del primer aspecto de la invención, la nicotina desmetilasa tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la nicotina desmetilasa de SEQ ID NO:2 o con un fragmento de una nicotina desmetilasa que tiene actividad enzimática alterada (por ejemplo, reducida) en comparación con el polipéptido de longitud completa. Deseablemente, la nicotina desmetilasa incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

En otro aspecto, la descripción describe una molécula de ácido nucleico aislada que contiene un promotor que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO:6, o un fragmento de la misma que dirige la transcripción. Deseablemente, el promotor (i) se induce tras tratamiento con etileno o durante la senescencia; y (ii) incluye (a) los pares de bases 1-2009 de SEQ ID NO:1, o (b) al menos 200 pares de bases consecutivos idénticos a 200 pares de bases consecutivos de la secuencia definida por los pares de bases 1-2009 de SEQ ID NO:1, o (c) una parte de nucleótidos de 20 pares de bases idéntica en secuencia a una parte de 20 pares de bases consecutivos de la secuencia expuesta en los pares de bases 1-2009 de SEQ ID NO:1.

Un aspecto adicional de la descripción describe un promotor de ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una nicotina desmetilasa, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico (a) la secuencia de SEQ ID NO:1, o (b) al menos 200 pares de bases consecutivas idénticas a 200 pares de bases consecutivas de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1,

(a) siendo dicha molécula de ácido nucleico ADN;

(b) comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico la secuencia de SEQ ID NO:1;

(c) codificando dicha molécula de ácido nucleico para una nicotina desmetilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;

(d) estando dicha molécula de ácido nucleico aislada operativamente unida a un promotor funcional en una célula vegetal; o (e) comprendiendo un promotor que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO:6, o un fragmento que comprende al menos 200 pares de bases consecutivas idénticas a 200 pares de bases consecutivas de SEQ ID NO:6, en el que dicho promotor dirige la transcripción, particularmente en el que el promotor se induce tras tratamiento con etileno o durante la senescencia.

3. Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1 ó 2,

(a) en el que la expresión de la nicotina desmetilasa se induce tras tratamiento con etileno o durante la senescencia; o

(b) en el que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de SEQ ID NO:6.

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, comprendiendo la molécula de ácido nucleico la secuencia de SEQ ID NO:5 o un fragmento que tiene al menos 200 pares de bases consecutivas que puede obtenerse a partir de SEQ ID NO:5.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, comprendiendo la molécula de ácido nucleico la secuencia de SEQ ID NO:7 o un fragmento que tiene al menos 200 pares de bases consecutivas que puede 25 obtenerse a partir de SEQ ID NO:7.

6. Planta de tabaco transgénica que tiene con respecto al nivel en una planta control una expresión reducida o actividad enzimática alterada de una nicotina desmetilasa codificada por una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1,

(a) comprendiendo dicha planta transgénica un transgén que tiene una identidad de secuencia del 91% o superior con SEQ ID NO:1, o con un fragmento de la misma, que, cuando se expresa en dicha planta transgénica, silencia la expresión génica de una nicotina desmetilasa de tabaco endógena;

(b) comprendiendo dicha planta transgénica un transgén que expresa una molécula antisentido de una nicotina desmetilasa de tabaco;

(c) comprendiendo dicha planta transgénica un transgén que codifica para una molécula de ARN bicatenario de una 35 nicotina desmetilasa de tabaco;

(d) comprendiendo dicha planta transgénica un transgén que, cuando se expresa en dicha planta transgénica, suprime conjuntamente la expresión de una nicotina desmetilasa de tabaco; o

(e) comprendiendo dicha planta transgénica una deleción en una nicotina desmetilasa endógena codificada por la secuencia de SEQ ID NO:1; y

en la que dicha expresión reducida o actividad enzimática alterada reduce el nivel de nornicotina en dicha planta.

7. Planta de tabaco transgénica según la reivindicación 6, en la que dicha nicotina desmetilasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

8. Componente vegetal de la planta de tabaco según la reivindicación 6, particularmente siendo dicho componente vegetal una semilla, tallo u hoja de tabaco, especialmente en el que dicha hoja está curada.

9. Producto de tabaco que comprende el componente vegetal según la reivindicación 8.

10. Semilla de la planta de tabaco según la reivindicación 6, comprendiendo dicha semilla dicho transgén o dicha 5 deleción.

11. Método de producción de una nicotina desmetilasa de tabaco, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una célula transformada con una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1;

(b) cultivar dicha célula transformada en condiciones para expresar dicha molécula de ácido nucleico aislada; y

(c) recuperar dicha nicotina desmetilasa de tabaco. 10 12. Nicotina desmetilasa de tabaco recombinante producida según el método de la reivindicación 11.

13. Método de aislamiento de una nicotina desmetilasa de tabaco o fragmento que tiene al menos 200 pares de bases consecutivas de la misma, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) poner en contacto la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 con una preparación de ácido nucleico de una célula vegetal en condiciones de hibridación que proporcionan la detección de secuencias de ácido nucleico que tienen una identidad de secuencia de al menos el 70% o superior con un ácido nucleico según la reivindicación 1; y (b) aislar dichas secuencias de ácido nucleico hibridantes.

14. Método de aislamiento de un ácido nucleico que comprende SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7, o fragmento que tiene al menos 200 pares de bases consecutivas del mismo, comprendiendo dicho método las etapas 20 de:

(a) proporcionar una preparación de ácido nucleico a partir de una célula vegetal;

(b) poner en contacto un par de oligonucleótidos que tienen identidad de secuencia con una región de SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7 con dicha preparación de ácido nucleico en condiciones adecuadas para la amplificación de ADN mediada por reacción en cadena de la polimerasa para producir un producto de reacción en

cadena de la polimerasa; y (c) aislar el ácido nucleico o fragmento del mismo producido en la etapa (c) .

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha preparación de ácido nucleico es ADN genómico.

16. Método según la reivindicación 14, en el que dicha preparación de ácido nucleico es ADNc.

17. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.

18. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 17, estando dicha molécula nucleica aislada operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico heteróloga.