CEPA DE RHODOCOCCUS RHODOCHROUS NCIMB 41164 Y SU USO COMO PRODUCTOR DE NITRILO HIDRATASA.

Un microorganismo que es Rhodococcus rhodochrous cepa NCIMB 41164.

Cepa de Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 y su uso como productor de nitrilo hidratasa La presente invención se refiere a un microorganismo y a métodos para cultivar y almacenar el microorganismo.

Se conoce bien el empleo de biocatalizadores, tales como microorganismos que contienen enzimas, para efectuar reacciones químicas. Se sabe que las enzimas nitrilo hidratasa catalizan la hidratación de nitrilos directamente hasta las correspondientes amidas. Típicamente, las enzimas nitrilo hidratasa pueden ser producidas por una variedad de microorganismos, pongamos por caso microorganismos de los géneros Bacillus, Bacteridium, Micrococcus, Brevibacterium, Cor y nebacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Pseudonocardia y Rhodococcus.

Muchas referencias han descrito la síntesis de nitrilo hidratasa dentro de microorganismos. Arnaud et ál., Agric. Biol. Chem. 41: (11) 2183-2191 (1977) describe las características de una enzima que denominan 'acetonitrilasa' en Brevibacterium sp R312 que degrada acetonitrilo hasta acetato a través del producto intermedio amídico. Asano et ál., Agric. Biol. Chem. 46: (5) 1183-1189 (1982) aislaron Pseudomonas chlororaphis B23 que producía nitrilo hidratasa para catalizar la conversión de acrilonitrilo en acrilamida, generando 400 g/l de acrilamida. El artículo de Yamada et ál., Agric. Biol. Chem. 50: (11) 2859-2865 (1986) , titulado "Optimum culture conditions for production by Pseudomonas chlororaphis B23 of nitrile hydratase", consideraba la optimización de los componentes del medio en el medio de crecimiento, incluyendo el inductor añadido para la síntesis de nitrilo hidratasa. Se encontró que la metacrilamida era el mejor inductor para este organismo. Se incluía metacrilamida en el cultivo al comienzo del crecimiento. Se ha encontrado que diversas cepas de la especie Rhodococcus rhodochrous producen muy eficazmente la enzima nitrilo hidratasa.

Watanabe et ál., Agric. Biol. Chem., 51 (12) : 3193-3199 (1987) describen el rastreo, el aislamiento y las propiedades taxonómicas de Rhodococcus sp. N-774 como una cepa productora de acrilamida. El medio de cultivo usado no comprende urea.

EP-0 307 926 describe el cultivo de Rhodococcus rhodochrous, específicamente la cepa J1 en un medio de cultivo que contiene iones cobalto. Se describe un procedimiento para producir biológicamente una amida en el que un nitrilo se hidrata mediante la acción de una nitrilo hidratasa producida por Rhodococcus rhodochrous J1, que se ha cultivado en presencia de ion cobalto. Se describe el uso de diversos inductores (incluyendo crotonamida) para la síntesis de nitrilo hidratasa. En una realización, se produce una amida en un medio de cultivo del microorganismo en el que está presente un nitrilo como sustrato. En otra realización, se añade un nitrilo como sustrato al medio de cultivo en el que se ha acumulado una nitrilo hidratasa para efectuar la reacción de hidratación. También hay una descripción de aislar las células microbianas y soportarlas en un portador adecuado, pongamos por caso mediante inmovilización, y a continuación ponerlas en contacto con un sustrato. La nitrilo hidratasa puede usarse para hidratar nitrilos en amidas, y en particular la conversión de 3-cianopiridina en nicotinamida.

EP-0 362 829 describe un método para cultivar bacterias de la especie Rhodococcus rhodochrous que comprende al menos uno de urea e ion cobalto para preparar las células de Rhodococcus rhodochrous que tienen actividad de nitrilo hidratasa. Se describe específicamente la inducción de nitrilo hidratasa en Rhodococcus rhodochrous J1 usando urea o derivados de urea, lo que incrementa notablemente la actividad de nitrilo hidratasa. La urea o sus derivados se añaden al medio de cultivo en una partida en un momento o secuencialmente y el cultivo se produce a lo largo de 30 horas o más, pongamos por caso hasta 120 horas.

Un artículo de Nagasawa et ál., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 783-788 (1991) , titulado "Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1", describe aislar J1 como una cepa que utiliza acetonitrilo que sintetiza dos nitrilo hidratasas diferentes y una nitrilasa dependiendo de las condiciones de cultivo usadas. Una nitrilo hidratasa es inducida óptimamente por urea y análogos de urea. La urea se añade al comienzo del procedimiento de cultivo y parece hacerse eficaz como un inductor sólo cuando el medio basal es rico en nutrientes. La inducción de la enzima empezaba gradualmente y se incrementaba en crecimiento hasta que alcanzaba un máximo después de 5 días de cultivo. Se encontró que la actividad disminuía con el cultivo prolongado.

Rhodococcus rhodochrous J1 también se usa comercialmente para fabricar monómero de acrilamida a partir de acrilonitrilo y este procedimiento ha sido descrito por Nagasawa y Yamada Pure Appl. Chem. 67: 1241-1256 (1995) .

Leonova et ál., Appl. Biochem. Biotechnol. 88: 231-241 (2000) , titulado "Nitrile Hydratase of Rhodococcus", describe el crecimiento y la síntesis de nitrilo hidratasa en Rhodococcus rhodochrous M8. La síntesis de nitrilo hidratasa de esta cepa es inducida por urea en el medio, actuando además la urea como una fuente de nitrógeno para el crecimiento mediante este organismo. También se requiere cobalto para una alta actividad de nitrilo hidratasa. Este documento bibliográfico estudia la inducción y los efectos metabólicos en general.

Leonova et ál., Appl. Biochem. Biotechnol. 88: 231-241 (2000) también indica que la acrilamida es producida comercialmente en Rusia usando Rhodococcus rhodochrous M8. La patente rusa 1731814 describe Rhodococcus rhodochrous cepa M8.

Precigou et ál., FEMS Microbiol. Lett. 204: 155-161 (2001) describen el uso de PCR para extraer DNA de muestras de suelo y para buscar genes de nitrilo hidratasa en el DNA extraído. Ambos tipos de genes que codifican nitrilo hidratasa que contienen hierro y cobalto se detectaron en DNA procedente de cultivos puros y muestras de suelo. Rhodococcus rhodochrous cepa M33 que produce nitrilo hidratasa sin la necesidad de un inductor tal como urea se describe en US-A-5827699. Esta cepa de microorganismo es un derivado de Rhodococcus rhodochrous M8.

La producción de monómero de acrilamida en particular es deseable a través de la ruta biocatalítica. En la publicación revisada de Yamada y Kobayashi, Biosci. Biotech. Biochem. 60: (9) 1391-1400 (1996) , titulada "Nitrile Hydratase and its Application to Industrial Production of Acr y lamide", se describe un informe detallado del desarrollo de una ruta biocatalítica hacia acrilamida. Tres catalizadores sucesivamente mejores y sus características para la producción de acrilamida y en particular el catalizador de tercera generación Rhodococcus rhodochrous J1 se describen con algún detalle.

Una desventaja importante del uso de biocatalizadores es la falta general de estabilidad observada con material microbiano húmedo durante el almacenamiento, el transporte y el uso. Incluso con enzimas y bacterias relativamente estables tales como hidratasas en células de rodococo, el potencial de deterioro antes del uso ha conducido a una aceptación dentro de la industria de la necesidad de procesar la suspensión de células biocatalíticas de algún modo, p. ej., mediante congelación o secado por congelación de la mezcla acuosa o alternativamente inmovilización de las células en alguna matriz de polímero. A fin de alcanzar una productividad máxima del biocatalizador, es importante que la actividad biocatalítica máxima se retenga durante su preparación y almacenamiento antes del uso. En Chaplin y Bucke (1990) En: Enzyme Technology, publicado por Cambridge University Press, p 47 (Enzyme preparation and use) , se identificó que la desactivación de la enzima puede estar provocada por calor, proteolisis, pH subóptimo, oxidación, desnaturalizantes e inhibidores irreversibles. Un número de sustancias puede provocar una reducción en el grado de la capacidad de la enzima para catalizar una reacción. Esto incluye sustancias que son desnaturalizantes de proteínas no específicos, tales como urea.

En la presentación, Protein Stability, de Willem JH van Berkel, Wageningen University, se consideraron los factores que pueden provocar la desactivación o el despliegue y estos incluían proteasas, oxidación debida a la presencia de oxígeno o radicales oxígeno y agentes desnaturalizantes que provocan un despliegue irreversible, tales como urea.

Chaplin... [Seguir leyendo]

1. Un microorganismo que es Rhodococcus rhodochrous cepa NCIMB 41164.

2. Un método para cultivar el microorganismo Rhodococcus rhodochrous cepa NCIMB 41164 en un medio de cultivo que contiene urea o un derivado de urea.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la urea o el derivado de urea se introduce en el medio de cultivo al menos seis horas después del comienzo del crecimiento del microorganismo.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el medio de cultivo contiene menos de 0, 2 g/l de la urea o el derivado de urea durante al menos las 6 primeras horas de cultivo del microorganismo y posteriormente se añade la urea o el derivado de urea al medio de cultivo.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el medio de cultivo contiene menos de 0, 2 g/l de la urea o el derivado de urea durante al menos las 12 primeras horas de cultivo del microorganismo y posteriormente se añade la urea o el derivado de urea al medio de cultivo.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que la urea o el derivado de urea se añade al medio de cultivo antes de 48 horas de cultivo.

7. Un procedimiento para preparar una amida a partir del nitrilo correspondiente, en el que el nitrilo se somete a una reacción de hidratación en un medio acuoso en presencia de un biocatalizador que es el microorganismo Rhodococcus rhodochrous cepa NCIMB 41164.

8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la amida es (met) acrilamida.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el biocatalizador se introduce en un medio acuoso y se alimenta (met) acrilonitrilo al medio acuoso de modo que la concentración de (met) acrilonitrilo en el medio acuoso se mantenga hasta 6% en peso.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la reacción continúa hasta que la concentración de acrilamida está entre 30 y 55% en peso.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el biocatalizador se recicla y se reutiliza.

12. Un método para mejorar la actividad biocatalítica del microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo se cultiva en un medio de cultivo que comprende urea o un derivado de urea, en el que la urea o el derivado de urea se introduce en el medio de cultivo al menos 6 horas después del comienzo del crecimiento del microorganismo.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el medio de cultivo contiene menos de 0, 2 g/l de la urea o el derivado de urea durante al menos las 6 primeras horas de cultivo del microorganismo y posteriormente se añade la urea o el derivado de urea al medio de cultivo.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en el que el medio de cultivo contiene menos de 0, 2 g/l de la urea o el derivado de urea durante al menos las 12 primeras horas de cultivo del microorganismo y posteriormente se añade la urea o el derivado de urea al medio de cultivo.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que la urea o el derivado de urea se añade al medio de cultivo antes de 48 horas de cultivo.

16. Una composición acuosa que comprende un biocatalizador que es el microorganismo Rhodococcus rhodochrous cepa NCIMB 41164 y en la que el biocatalizador está en la forma de un microorganismo de células libres que crece no activamente.

17. Un método para almacenar el biocatalizador que es el microorganismo Rhodococcus rhodochrous cepa NCIMB 41164 en la forma de un microorganismo de células libres que crece no activamente, en un medio de almacenamiento acuoso.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el biocatalizador se almacena a una temperatura por encima de su punto de congelación, preferiblemente por encima de 0º C y más preferiblemente entre 4 y 3 0º C.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en el que el biocatalizador se almacena durante un período de al menos dos días, preferiblemente entre 3 y 28 días y más preferiblemente entre 5 y 14 días.