FLOCULACION DE MATERIAL CELULAR.

Procedimiento de floculación de material celular a partir de un medio de suspensión que contiene material celular microbiano,

seleccionado del grupo consistente en células, residuos de células y esporas, cuyo medio de suspensión es un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación, que comprende añadir al medio de suspensión un primer material polimérico que es catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, y posterior o simultáneamente añadir al medio de suspensión un segundo material polimérico catiónico que es sustancialmente no iónico y que tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de la mezcla monómera) o catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y hasta 20 dl/g, y permitir la floculación del material celular

Floculación de material celular.

Esta invención se refiere a procedimientos para flocular material celular en medios de suspensión. Con frecuencia es deseable separar material celular (tal como células y/o restos de células) de un medio de suspensión líquido que contiene el material celular. Una forma de realizar esto consiste en flocular el material celular de manera que los flóculos formados puedan ser separados del medio de suspensión líquido. Después de su separación, el propio material celular puede ser utilizado adicionalmente. Como alternativa, el material celular puede ser desechado y se puede emplear el contenido del medio de suspensión.

Sin embargo, ha resultado ser difícil encontrar sistemas de floculación que proporcionen un rendimiento de floculación adecuado en los medios de suspensión de los cuales ha de ser separado frecuentemente el material celular. En particular, suele ser necesario separar material celular de medios complejos tal como un medio de crecimiento. Se ha comprobado que la floculación empleando floculantes convencionales, tales como polímeros, es problemática en estos entornos.

Sitkey et al en Biotechnology Techniques, Vol. 6, no. 1, 49-52 (1992) describen la separación de células, sólidos y coloides de un caldo de fermentación. La finalidad de la separación consiste en recuperar enzimas extracelulares presentes en el medio de suspensión. Se describen sesenta materiales poliméricos para utilizarse como agentes de floculación. Los tipos de floculante utilizados son débilmente catiónicos, medianamente catiónicos, fuertemente catiónicos, débilmente aniónicos, medianamente aniónicos y no iónicos. Sin embargo, de acuerdo con los autores sólo dos polímeros proporcionan una clarificación eficaz. Estos fueron los polímeros medianamente aniónicos Sedipur T1 y Sedipur TF5, suministrados por BASF. Se describe la adición de varios polímeros catiónicos y no iónicos. Cada uno de ellos se añade como una sola dosis como el único floculante y es eficaz a la hora de proporcionar la clarificación del caldo de fermentación.

Mukhopadhyay et al en Biotechnology Techniques, vol. 4, no. 2, 121-126 (1990) también intentan separar sólidos suspendidos de un caldo de fermentación con el fin de recuperar enzimas extracelulares disueltas en el medio de suspensión. Los autores utilizan diferentes sistemas con el fin de mejorar la coagulación o floculación. Los agentes floculantes empleados fueron ácido acético glacial, cloruro de calcio, sulfato de aluminio y poliacrilamida catiónica. También se emplearon sistemas de tales agentes en donde se añadieron dos o más de los agentes al medio de suspensión. En particular, los autores describen sistemas en donde se emplean sulfato de aluminio y poliacrilamida catiónica como los dos agentes floculantes. Las cantidades de la poliacrilamida catiónica empleadas en los sistemas ejemplificados fueron de 0,1, 0,3 y 0,5 g/l (100, 300 y 500 ppm). La cantidad empleada de sulfato de aluminio fue siempre de 5,0 g/l (5.000 ppm). Aunque se obtuvo la clarificación del caldo de fermentación empleando este sistema, los autores establecen que, bajo alto esfuerzo cortante, los flóculos formados se desintegraron en partículas más pequeñas. Esto impide la sedimentación. De este modo, este sistema puede clarificar el caldo de fermentación pero no produce flóculos robustos. Por este motivo, los procedimientos que pueden ser empleados posteriormente para separar los flóculos del sobrenadante son limitados. En particular, los autores advierten incluso contra una centrifugación moderada.

La publicación EP-A-448.926 describe un sistema para la floculación de enzimas. El material celular, tal como células y restos celulares, se separa de un medio de suspensión tal como caldo de fermentación por medios mecánicos, tal como centrifugado, y la enzima que permanece en el sobrenadante es floculada empleando un agente floculante particular. El agente floculante es una mezcla de un polímero de acrilamida Mannich y un polímero de haluro de dialildimetilamonio. En el sistema descrito, es necesario separar primero el material celular del caldo de fermentación por medios mecánicos, de manera que no contamine más tarde a los productos precipitados por vía química.

Weir et al en Biotechnology Techniques, vol. 7, no. 3 (Marzo 1993) pp 199-204, describen la floculación de células en un caldo de fermentación empleando quitosano, un polielectrolito catiónico que, según se indica, es neutro por encima de pH 7,9. Los mismos autores también describen, en Biotechnology Techniques, vol. 8, no. 2 (Febrero 1994) pp 129-132, el uso de varios polímeros aniónicos como un tratamiento previo antes de utilizar quitosano como floculante.

Se sabe que la floculación de células microbianas en un medio de cultivo líquido mediante polielectrolitos catiónicos ayuda a separar las células del medio. Cuando el medio contiene altas concentraciones de polielectrolitos aniónicos como constituyentes del medio y/o producidos por las células, la adición de floculantes catiónicos de alto peso molecular produce flóculos. Estos flóculos estarán contaminado con una mezcla de floculante concentrado y complejo de polielectrolito formado a partir de un polímero aniónico y catiónico (polisal) y/o un precipitado de un polímero aniónico y catiónico que causa la adherencia de los flóculos a la instalación de procesado. Un procedimiento alternativo de adición de floculantes de polímeros catiónicos de bajo peso molecular a los cultivos bacterianos que contienen altas concentraciones de polielectrolitos aniónicos, requiere dosis de polímero elevadas en el caso de que se quiera conseguir una floculación adecuada, debido a la formación de complejo de polímero aniónico y catiónico y/o precipitados. Además, se ha comprobado que los flóculos producidos empleando floculantes de polímeros catiónicos de bajo peso molecular son considerablemente más débiles que los flóculos producidos con polímeros de alto peso molecular. Bajo esfuerzo cortante, las células son liberadas de los flóculos producidos usando floculantes de polímeros catiónicos de bajo peso molecular y ello se traduce en una reducción de la eficiencia de separación.

Sería deseable poder proporcionar un sistema eficiente para la separación de material celular de un medio de suspensión tal como caldo de fermentación. También sería deseable poder utilizar una variedad de métodos de separación después de la floculación y poder proporcionar flóculos suficientemente robustos para soportar los métodos de separación y, si es necesario, su posterior uso.

De acuerdo con la invención se proporciona un procedimiento de floculación de material celular a partir de un medio de suspensión que contiene material celular microbiano, seleccionado del grupo consistente en células, residuos de células y esporas, cuyo medio de suspensión es un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación, que comprende añadir al medio de suspensión un primer material polimérico que es catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, y posterior o simultáneamente añadir al medio de suspensión un segundo material polimérico catiónico que es sustancialmente no iónico y que tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de la mezcla monómera) o catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y hasta 20 dl/g, y permitir la floculación del material celular.

Se ha comprobado que el uso del primero y segundo materiales poliméricos antes definidos con el fin de flocular el material celular da lugar a la producción de flóculos robustos adecuados para su separación bajo alto esfuerzo cortante sin la necesidad de utilizar dosis excesivas de polímeros. En particular, se ha comprobado que tratando previamente un caldo microbiano que contiene altos niveles de polielectrolito aniónico con polímero catiónico con una viscosidad inherente no mayor de 2 dl/g y posteriormente con floculante polimérico que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g, da lugar a flóculos robustos que no contienen polímero concentrado adherente. La dosis total de polímero es mayor que en el método conocido que utiliza polímero con una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g únicamente pero menor que en el método conocido que utiliza polímero con una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g por sí solo.

De manera sorprendente, también se ha comprobado que la dosis total de polímeros del sistema de dos polímeros de la invención se puede reducir hasta en un 30%...

1. Procedimiento de floculación de material celular a partir de un medio de suspensión que contiene material celular microbiano, seleccionado del grupo consistente en células, residuos de células y esporas, cuyo medio de suspensión es un medio de crecimiento, de manera que el material celular es floculado en el caldo de fermentación, que comprende añadir al medio de suspensión un primer material polimérico que es catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca no mayor de 2 dl/g, y posterior o simultáneamente añadir al medio de suspensión un segundo material polimérico catiónico que es sustancialmente no iónico y que tiene un contenido en monómero iónico por debajo de 3% en peso (basado en el peso de la mezcla monómera) o catiónico y que tiene una viscosidad intrínseca de al menos 4 dl/g y hasta 20 dl/g, y permitir la floculación del material celular.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el primer material polimérico tiene una densidad de carga catiónica teórica de al menos 5 meq/g y no mayor de 25 meq/g, en donde la densidad de carga catiónica teórica es la densidad de carga obtenida mediante cálculo a partir de la composición monomérica que se intenta utilizar para formar el polímero.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en donde el segundo material polimérico es catiónico.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo material polimérico tiene una densidad de carga catiónica teórica no mayor de 4 meq/g.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo material polimérico es un copolímero de un monómero de (met)acrilato de dialquilaminoalquilo como una sal cuaternaria o una sal de adición de ácido con un monómero no iónico etilénicamente insaturado, y preferentemente es un copolímero de acrilamida y acrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado con cloruro de metilo.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión de manera simultánea.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión como una mezcla pre-formada.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la dosis activa del segundo material polimérico no es mayor de 500 ppm, preferentemente no mayor de 250 ppm, basado en el peso del medio de suspensión.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la dosis activa del primer material polimérico no es mayor de 1.000 ppm, preferentemente no mayor de 500 ppm, basado en el peso del medio de suspensión.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión como una mezcla pre-formada y la dosis activa de la mezcla no es mayor de 500 ppm, preferentemente no mayor de 250 ppm, basado en el peso del medio de suspensión.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primero y segundo materiales poliméricos se añaden al medio de suspensión en una relación de 60:40 a 80:20 del primero: segundo material polimérico, preferentemente de 65:35 a 75:25 del primero: segundo material polimérico.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde el primer material polimérico es poliDADMAC y el segundo material polimérico es un copolímero de acrilamida y acrilato de dimetilaminoetilo cuaternizado con cloruro de metilo.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material celular floculado se separa del medio de suspensión y se utiliza como un catalizador.