Células huésped que contienen vectores de integración múltiple.

Una célula huésped obtenida por selección clonal que comprende un genoma,

en el que dicho genomacomprende al menos 10 copias de un vector retroviral seudotipado, en la que dicho vector retroviral comprende almenos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor interno a las repeticiones terminales largas 5' y 3' dedicho vector retroviral, en el que dicho gen codifica una proteína secretada, en el que dicha célula huésped secaracteriza porque sintetiza al menos 1 picogramo de dicha proteína exógena al día.

Células huésped que contienen vectores de integración múltiple

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de proteínas en células huésped y, más particularmente, a células huésped que contienen múltiples copias integradas de un vector de integración.

Antecedentes de la invención

La industria de la biotecnología farmacéutica se basa en la producción de proteínas recombinantes en células de mamífero. Estas proteínas son esenciales para el tratamiento terapéutico de muchas enfermedades y afecciones. En muchos casos, el mercado para estas proteínas supera un billón de dólares al año. Ejemplos de proteínas producidas de forma recombinante en células de mamífero incluyen eritropoyetina, factor VIII, factor IX e insulina. Para muchas de estas proteínas, se prefiere la expresión en células de mamífero sobre expresión en células procariotas dada la necesidad de una modificación postraduccional correcta (p. ej., glicosilación o silación; véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.721.121, incorporada en el presente documento por referencia) .

Se conocen varios procedimientos para crear células huésped que expresen proteínas recombinantes. En los procedimientos más básicos, se introduce en la célula huésped una construcción de ácido nucleico que contiene un gen que codifica una proteína heteróloga y regiones reguladoras adecuadas y se deja integrar. Los procedimientos de introducción incluyen precipitación en fosfato cálcico, microinyección, lipofección y electroporación. En otros procedimientos se usa un esquema de selección para amplificar la construcción de ácido nucleico introducida. En estos procedimientos, las células se co-transfeccionan con un gen que codifica un marcador de selección amplificable y un gen que codifica una proteína heteróloga (véase, por ejemplo, Schroder y Friedl, Biotech. Bioeng. 53 (6) :547-59 [1997]) . Tras la selección de los transformantes iniciales, los genes transfeccionados se amplifican mediante incremento escalonado del agente selectivo (p. ej., dihidrofolato reductasa) en el medio de cultivo. En algunos casos, el gen exógeno se puede amplificar varios cientos de veces mediante estos procedimientos. Otros procedimientos de expresión proteica recombinante en células de mamífero usan transfección con vectores episomales (p. ej., plásmidos) .

Los procedimientos actuales para crear líneas celulares de mamífero para la expresión de proteínas recombinantes sufren serios inconvenientes. (Véase, por ejemplo, Mielke, y col., Biochem. 35:2239-52 [1996]) . Los sistemas episomales permiten niveles elevados de expresión de la proteína recombinante pero con frecuencia solo son estables durante un corto periodo de tiempo (véase, por ejemplo, Klehr y Bode, Mol. Genet. (Life Sci. Adv.) 7:47-52 [1988]) . Las líneas celulares de mamífero que contienen genes exógenos integrados son algo más estables, pero hay cada vez más pruebas de que la estabilidad depende de la presencia de únicamente unas pocas copias, o incluso una sola copia, del gen exógeno.

Las técnicas de transfección estándar favorecen la introducción de múltiples copias del transgen en el genoma de la célula huésped. En muchos casos se ha demostrado que la integración múltiple del transgen es intrínsecamente inestable. Esta inestabilidad intrínseca puede deberse al característico modo de integración cabeza-cola que estimula la pérdida de secuencias de codificación mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, Weidle y col., Gene 66:193-203 [1988]) especialmente cuando se transcriben los transgenes (véase, por ejemplo, McBumey y col., Somatic Cell Molec. Genet. 20:529-40 [1994]) . Las células huésped también tienen mecanismos de defensa epigenéticos dirigidos a múltiples acontecimientos de integración de copias. En plantas, este mecanismo se ha denominado “co-supresión”. (Véase, por ejemplo, Allen y col., Cell 5:603-13, (1993) . De hecho, no es infrecuente que el nivel de expresión esté inversamente relacionado con el número de copias. Estas observaciones son consistentes con los hallazgos de que múltiples copias de genes exógenos se inactivan mediante metilación (véase, por ejemplo, Mehtali y col., Gene 91:179-84 [1990]) y la posterior mutagénesis (véase, por ejemplo, Kricker y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1075-79 [1992]) o silenciarse mediante formación de heterocromatina (véase, por ejemplo, Dorer y Henikoff, Cell 77:993-1002 [1994]) .

De acuerdo con esto, en la técnica se necesitan procedimientos mejorados para fabricar células huésped que expresen proteínas recombinantes. Preferentemente, las células huésped serán estables durante periodos extendidos de tiempo y expresan la proteína codificada por un transgen a niveles elevados.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y se refiere a la producción de proteínas en células huésped y, más particularmente, a células huésped que contienen múltiples copias integradas de un vector de integración. La presente divulgación no está limitada a células huésped transfeccionadas con un número concreto de vectores de integración. De hecho, se pueden concebir células huésped que contienen un amplio abanico de vectores de integración. En algunos casos, una célula huésped puede comprender un genoma que contiene, preferentemente, al menos aproximadamente dos vectores de integración integrados. En otras realizaciones más, el genoma comprende, preferentemente, al menos 3 vectores de integración integrados y, lo más preferentemente, al menos 4 vectores de integración integrados, 5 vectores de integración integrados, 6 vectores de integración integrados, 7

vectores de integración integrados, 10 vectores de integración integrados, 15 vectores de integración integrados, 20 vectores de integración integrados o 50 vectores de integración integrados.

Las células huésped no se limitan a contener vectores que codifican una única proteína de interés seleccionada (es decir, proteína exógena) . De hecho, se contempla que las células huésped se transfeccionen con vectores que codifican múltiples proteínas de interés secretadas.

En algunas realizaciones, el vector de integración comprende al menos dos genes exógenos. En otras realizaciones, los al menos dos genes exógenos están dispuestos en una secuencia policistrónica. En otras realizaciones más, los al menos dos genes exógenos están separados por un sitio interno de entrada al ribosoma. En otras realizaciones, los al menos dos genes exógenos están dispuestos en una secuencia policistrónica. En otras realizaciones más, los dos genes exógenos comprenden una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina y una cadena ligera de una molécula de inmunoglobulina. En otras realizaciones, uno de los al menos dos genes exógenos es un marcador seleccionable. En otras realizaciones más, las células huésped comprenden al menos 2 copias integradas de un primer vector de integración que comprende un primer gen exógeno y al menos 1 copia integrada de un segundo vector de integración u otro vector que comprende un segundo gen exógeno. En otras realizaciones más, las células huésped comprenden al menos 10 copias integradas de un primer vector de integración que comprende un primer gen exógeno y al menos 1 copia integrada de un segundo vector de integración u otro vector que comprende un segundo gen exógeno.

En algunas realizaciones preferidas, los vectores de integración comprenden al menos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor. La presente divulgación no está limitada a vectores que contienen un promotor concreto. De hecho se contemplan varios promotores. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo constituido por el promotor de alfa-lactoalbúmina, el promotor de citomegalovirus y la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney. En otras realizaciones, los vectores de integración comprenden además una señal de secreción unida funcionalmente al gen exógeno. En otras realizaciones más, los vectores de integración comprenden además un elemento de exportación de ARN unido funcionalmente al gen exógeno.

La presente divulgación no está limitada a un vector de integración concreto. De hecho se contemplan varios vectores de integración. En algunas realizaciones, el vector de integración se selecciona del grupo que consiste en un vector retroviral, un vector lentiviral y un vector transposón. En algunas... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped obtenida por selección clonal que comprende un genoma, en el que dicho genoma comprende al menos 10 copias de un vector retroviral seudotipado, en la que dicho vector retroviral comprende al menos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor interno a las repeticiones terminales largas 5’ y 3’ de dicho vector retroviral, en el que dicho gen codifica una proteína secretada, en el que dicha célula huésped se caracteriza porque sintetiza al menos 1 picogramo de dicha proteína exógena al día.

2. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dichos vectores retrovirales comprenden además una secuencia de señal de secreción unida funcionalmente a dicho gen exógeno.

3. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dichos vectores retrovirales comprenden además un elemento de exportación de ARN unido funcionalmente a dicho gen exógeno, y

en la que dichos vectores retrovirales comprenden, preferentemente, al menos dos genes exógenos.

4. La célula huésped de la reivindicación 3, en la que uno de dichos al menos dos genes exógenos es un marcador seleccionable.

5. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dicho vector retroviral comprende repeticiones terminales largas seleccionadas del grupo constituido por las repeticiones terminales largas de MoMLV, MoMuSV y MMTV, y

en la que dicho vector retroviral es, preferentemente, un vector lentiviral.

6. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dicha célula huésped se selecciona de células de ovario de hámster chino, células de riñón de cría de hámster y células epiteliales mamarias bovinas, y

en la que el genoma es, preferentemente, estable durante más de 10 pases, preferentemente más de 50 pases o, más preferentemente, más de 100 pases.

7. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que dicho promotor se selecciona del grupo constituido por el promotor de alfa-lactoalbúmina, el promotor de citomegalovirus y la repetición terminal larga del virus de la leucemia murina de Moloney, comprendiendo preferentemente además un primer vector de integración que codifica una primera proteína de interés secretada, comprendiendo además al menos 1 copia integrada de un un segundo vector de integración que codifica una segunda proteína de interés secretada.

8. Un procedimiento ex vivo para transfeccionar células huésped, en el que más de 10 copias de un vector de expresión para la proteína de interés se insertan en el genoma de la célula huésped de modo que las células huésped transfeccionadas sintetizan al menos 1 picogramo por célula al día de la proteína de interés, caracterizado porque una célula huésped que comprende un genoma se pone en contacto con un vector retroviral seudotipado y que, posteriormente, se obtiene por selección clonal una célula huésped transfeccionada, en el que el vector retroviral comprende al menos un gen exógeno unido funcionalmente a un promotor interno en las repeticiones terminales largas retrovirales 5' y 3' y la célula huésped se selecciona del grupo constituido por células de ovario de hámster chino, células renales de cría de hámster y células epiteliales mamarias bovinas.

9. Una célula huésped que puede obtenerse mediante el procedimiento de la reivindicación 8.

10. Un procedimiento para expresar una proteína de interés, que comprende:

1) proporcionar:

a) una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

2) cultivar dichas células huésped en condiciones tales que se expresa dicha proteína de interés; 3) aislar dicha proteína de interés.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho genoma de dicho huésped comprende al menos dos vectores de integración, en el que cada uno de dichos al menos dos vectores de integración comprende un gen exógeno diferente.

12. Un procedimiento que comprende:

1) proporcionar:

a) una célula huésped de mamífero que comprende un genoma, comprendiendo dicho genoma múltiples copias de un vector retroviral seudotipado que comprende un promotor unido funcionalmente a un gen exógeno que codifica una primera proteína de interés secretada, y b) segundos vectores retrovirales seudotipados que comprenden un gen exógeno que codifica una segunda proteína de interés secretada; y 2) poner en contacto dicha célula huésped de mamífero con dichos segundos vectores retrovirales, en el que al menos 10 copias de dichos segundos vectores retrovirales se insertan en el genoma de la célula huésped de mamífero, de modo que las células huésped sintetizan al menos 1 picogramo de la segunda proteína de interés al día, que se caracteriza porque una célula huésped que comprende un genoma se pone en contacto con un

vector retroviral a una multiplicidad de infección superior a 100 y que, posteriormente se obtiene por selección clonal una célula huésped transfeccionada.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dichas condiciones comprenden poner en contacto dicho huésped a una multiplicidad de infección de 100 a 1.000.

14. El procedimientos de la reivindicación 8, 10 o 12, en el que dicho vector retroviral es un vector lentiviral, y

en el que dicho vector retroviral es, preferentemente, un vector retroviral seudotipado que comprende una glicoproteína G.

15. El procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende la etapa de aislar dicha proteína de interés.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4 SEC ID Nº 1 Promotor híbrido de alfa-lactoalbúmina bovina-humana

1. 1525 Región flanqueante en 5’ de lactoalbúmina alfa bovina (-2000 a -550 desde el punto de partida de la transcripción de la alfa-lactoalbúmina bovina)

1526 - 2056 Región flanqueante en 5’ de alfa-lactoalbúmina humana (-600 a +15 desde el punto de partida de la transcripción de la alfa-lactoalbúmina humana)

2057 - 2101 Sitio de clonación múltiple

Figura 5 SEC ID Nº 2 Secuencia de PPE mutada

1. 119 PPE mutad.

12. 126 Ligado.

12. 245 PPE mutada

Figura 6 SEC ID Nº 3

1. 583 IRES

584 - 640 Región de codificación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina modificada

641 - 680 Sitio de clonación múltiple

Figura 7a SEC ID Nº 4

Vector MN14 de CMV

Figura 7b

1 -812 Promotor/potenciador del CMV 853 - 855 Codón de iniciación del péptido señal del gen de la cadena pesada del

anticuerpo MN14 2257 - 2259 Codón de iniciación del gen de la cadena pesada del anticuerpo MN14 2271 - 2846 IRES del EMCV 2847 - 2849 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 2904 - 2906 Primer codón del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 maduro 3543 - 3544 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 3614 - 4207 3’LTR de MoMuLV

Figura 8a SEC ID Nº 5

Vector LL2 de CMV

Figura 8b

1 -812 Promotor/potenciador del CMV 852 - 854 Codón de iniciación del péptido señal del gen de la cadena pesada del

anticuerpo LL2 2247 - 2249 Codón de terminación de la cadena pesada del anticuerpo LL2 2261 - 2836 IRES del EMCV 2837 - 2839 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 2894 - 2896 Primer codón del gen de la cadena ligera del anticuerpo LL2 maduro 3551 - 3553 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo LL2 3622 - 4210 3’LTR de MoMuLV

Figura 9a SEC ID Nº 6

Vector MN14 de MMTV

Figura 9b

1. 1457 LTR del virus del tumor de mama de ratón 1475 - 1726 Secuencia de PPE con doble mutación

Figura 9c

1752 - 1754 Codón de iniciación del péptido señal de la cadena pesada de MN14 3156 - 3158 Codón de terminación de la cadena pesada de MN14 3170 - 3745 IRES del EMCV 3746 - 3748 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 3803 - 3805 Primer codón del gen de la cadena ligera del MN14 maduro 4442 - 4444 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 4487 - 5078 Secuencia WPRE 5133 - 5372 3’LTR de MoMuLV

Figura 10a SEC ID Nº 7

Vector MN14 de la alfa-lactoalbúmina Figura 10b Figura 10c

Figura 10d

1. 658 5’ LTR de MoMuSV

659 - 1468 Región de empaquetamiento extendida 1512 - 2306 Gen de resistencia a neomicina 2661 - 4896 Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana 5084 - 5327 Secuencia de PPE con mutación doble 6207 - 6209 Codón de iniciación del péptido señal del gen de la cadena pesada del anticuerpo

MN14 6611 - 6613 Codón de terminación de la cadena pesada del anticuerpo MN14 6625 - 7200 IRES de EMCV 7201 - 7203 Codón de iniciación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 7258 - 7260 Primer codón del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 7897 - 7899 Codón de terminación del gen de la cadena ligera del anticuerpo MN14 7938 - 8529 Secuencia de WPRE 8600 - 9138 3’ LTR del virus de la leucemia murina de Moloney

Figura 11a SED ID Nº 8

Vector Bot de alfa-lactoalbúmina Figura 11b

Figura 11c

1. 2053 Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana 2093 - 2336 Secuencia de PPE con mutación doble 2387 - 2443 Región de codificación del péptido señal cc49 2444 - 3088 Región de codificación de Fab de la cadena ligera del anticuerpo Bot 3112 - 3686 IRES de EMCV 3687 - 3745 Región de codificación del péptido señal de la alfa-lactoalbúmina bovina 3746 - 4443 Región de codificación de Fab de la cadena pesada del anticuerpo Bot 4481 - 5072 Secuencia WPRE 5118 - 5711 3’ LTR del virus de la leucemia murina de Moloney

Figura 12a SEC ID Nº 9 Vector LSNRL

Figura 12b

1. 589 5’ LTR de MoMuSV 659 - 897 Región de empaquetamiento retroviral 1034 - 1714 Antígeno de superficie de la hepatitis B 2279 - 2595 Promotor de RSV 2951 - 3745 Gen de la neomicina fosfotransferasa 4537 - 5130 3’ LTR de MoMuLV

Figura 13a SEC ID Nº 10

Vector cc49IL2 de alfa-lactoalbúmina

Figura 13b

1. 2055 Región flanqueante en 5’ de la alfa-lactoalbúmina bovina/humana 2098 - 4011 Región de codificación de cc49-IL2 4068 - 4661 3’ LTR de MoMuLV

Figura 14a SEC ID Nº 11

Vector YP de alfa-lactoalbúmina Figura 14b

1. 583 IRES 584 - 628 Región de codificación del péptido señal de la caseína alfa-S1 bovina modificada 629 - 668 Sitio de clonación múltiple

Figura 16a SEC ID Nº: 13

Vector LNBOTDC Figura 16b

Figura 16c

LTR 5’ del virus del sarcoma murino de Moloney 1 - 589 Región de empaquetamiento extendida del virus de la leucemia murina de Moloney 659 - 1468 Gen de resistencia a neomicina 1512 - 2306 Promotor del CMV 2656 - 3473 Región de codificación del péptido señal de cc49 3516 - 3572 Fab 5 de la cadena ligera de Bot 3573 - 4217 IRES de EMCV (Clonetech) 4235 - 4816 Región de codificación del péptido señal de α-LA bovina modificada 4817 - 4873 Fab 5 de la cadena pesada de Bot 4874 - 5572 LTR 3’ del virus de la leucemia murina de Moloney 5662 - 6255

Figura 19a SEC ID Nº 34

Vector LNBOTDC Figura 19b Figura 19c

Figura 19d

Características:

149 - 737 LTR 5’ del virus del sarcoma murino de Moloney

807 - 1616 Región de empaquetamiento extendido

1680 - 1735 Promotor EM7 (promotor del bacteriófago T7)

1754 - 2151 Secuencia de codificación del gen de resistencia a blasticidina

2310 - 2440 Señal y sitio de poli A de SV40

2603 - 3420 CMV IE promotor

3675 - 4988 Receptor acoplado a proteína G (GPCR)

5071 - 5646 IRES

5647 - 5703 Péptido señal de la α-lactoalbúmina bovina

5704 - 6372 Cadena ligera del anticuerpo “humanizado”

6553 - 7146 LTR 3’ de MoMuLV

7683 Origen de replicación

9302 - 8442 Secuencia de codificación de b-lactamasa