La invención se relaciona con oligonucleótidos de cadena sencilla (aptámeros) que son capaces de unirse de forma específica a las proteínas histona de microorganismos del género Leishmanla,

así como a los usos de dichos oligonucleótidos para la diagnosis y el tratamiento de las leishmaniasis

Aptámeros específicos para histonas de Leishmania.

Campo técnico de la invención

La invención se relaciona con oligonucleótidos de cadena sencilla (aptámeros) que son capaces de unirse de forma específica a las proteínas histona de microorganismos del género Leishmania, así como a los usos de dichos oligonucleótidos para la diagnosis y el tratamiento de las leishmaniasis.

Antecedentes de la invención

Leishmania es un protozoo que, en el vertebrado, desarrolla un ciclo de vida intracelular, utilizando el macrófago como célula hospedadora. Dentro de estas células, el parásito se desarrolla en los fagolisosomas donde es capaz de soportar tanto el pH ácido como la presencia de las numerosas enzimas hidrolíticas que contiene este orgánulo. Los protozoos del género Leishmania son el agente causante de la leishmaniasis, una enfermedad que incluye un amplio espectro de síntomas clínicos que varían desde lesiones cutáneas que curan espontáneamente hasta infecciones viscerales que pueden llegar a conducir a la muerte del paciente. Datos recientes de la OMS indican que la leishmaniasis es ahora endémica en 88 países de cinco continentes -África, Asia Europa, Norteamérica y América del Sur- con un total de 350 millones de personas con riesgo de padecerla. Se calcula que esta enfermedad afecta a más de 15.000.000 de personas en todo el mundo, localizándose su máxima incidencia en aproximadamente 15 naciones entre las que se incluyen varios países del área mediterránea. En lo que a América se refiere, se estima que cada año se producen 60.000 nuevos casos de leishmaniasis tegumentaria americana (LTA), todos ellos localizados en una región habitada por unos 59 millones de personas. Además, desde 1993, las regiones en las que la leishmaniosis es endémica se han expandido significativamente lo que está acompañado por un incremento en el número de casos registrados de la enfermedad. Además, el SIDA y otras enfermedades inmunosupresivas alimentan el riesgo de personas infectadas por Leishmania que desarrollan leishmaniasis visceral (WHO 2000).

Hasta el momento, los métodos de diagnóstico de la leishmaniasis se han basado en la detección de la respuesta humoral a la infección en pacientes. Así, la solicitud de patente americana US2005287176 describe un polipéptido quimérico formado por varios determinantes antigénicos de distintas proteínas de Leishmania dispuestos en tándem, incluyendo determinantes antigénicos de la histona 2A, de las proteínas ácidas ribosomales LiP2 y LiP2b, así como de la proteína ribosomal PO. La solicitud de patente internacional WO2005044301 describe la secuencia de histona 2A y sugiere su uso para la identificación de anticuerpos en suero de pacientes. La solicitud de patente europea EP0997734 describe un método diagnóstico para la diagnosis de la leishmaniasis visceral en el que se investiga la aglutinación de un preparado de promastigotes de Leishmania tripsinizados y teñidos con azul brillante de Coomassie tras su adición a una muestra de suero.

Sin embargo, estos ensayos son dependientes de la aparición de una respuesta humoral en el paciente. Por ello, este tipo de ensayos no resultan de utilidad para la detección de muchas las leishmaniasis humanas, ya que estas ocurren fundamentalmente en individuos inmunodeprimidos, que no desarrollan una respuesta humoral completa. Por otro lado, es frecuente que aparezcan animales que desarrollan los signos de la enfermedad pero en los que el título de anticuerpos no es lo suficientemente alto como para que los anticuerpos puedan ser detectados.

Por ello, es necesario disponer de ensayos que permitan detectar el parásito en sí en lugar de ensayos dirigidos a detectar la presencia de la respuesta humoral en el paciente. Sin embargo, este tipo de ensayos se enfrenta al problema de que no existen anticuerpos comerciales contra muchos de los antígenos de Leishmania. La solicitud de patente EP0819766 describe varios polinucleótidos de Leishmania que pueden servir de base para su detección en muestras mediante la amplificación mediante PCR usando cebadores específicos así como para distinguir distintas especies de Leishmania. La solicitud de patente ES216996 describe un método para la detección de L. infantum mediante la amplificación por PCR de un marcador específico del kinetoplasto seguido de la detección mediante ELISA del amplicón generado en la PCR. Por otro lado, Moreno, M. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 308:214-218) han descrito aptámeros de ADN específicos para la proteína KMP-11 de L. infantum y han sugerido su posible uso como herramienta diagnóstica. Sin embargo, existe aún una necesidad en la técnica de proporcionar métodos adicionales para el diagnóstico de la leishmaniasis y, más concretamente, de agentes capaces de unirse a antígenos de Leishmania con la suficiente rapidez y afinidad como para poder ser utilizados con fines diagnósticos.

Compendio de la invención

La presente invención se basa en la identificación por parte de los inventores de aptámeros de Leishmania que son capaces de unirse a la proteína histona 2A con alta afinidad, de forma que permiten la detección específica de dicha proteína sin mostrar ninguna reactividad cruzada con la histona 2A de especies en las que L. infantum habitualmente se hospeda, abriendo la puerta a un método alternativo para la diagnosis de la leishmaniasis.

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un ácido nucleico de cadena sencilla que es capaz de unirse específicamente a una histona de un organismo perteneciente al género Leishmania.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un aptámero definido por la fórmula

5'-GCGGATGAAGACTGGTGT-X-GCCCTAAATACGAGCAAC-3'

en donde X es un oligonucleótido seleccionado del grupo de SEQ ID NO: 8 a 14 o una variante funcionalmente equivalente del mismo o bien que comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1 a 7 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

En otro aspecto, la invención se relaciona al uso de al menos un aptámero de la invención para la detección de Leishmania.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico de una infección por Leishmania que comprende

En otro aspecto, la invención se relaciona con un aptámero o una mezcla de aptámeros de la invención para su uso en medicina.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende al menos un aptámero según la invención opcionalmente en combinación con uno o más soportes, excipientes o solventes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de al menos un aptámero de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección por Leishmania.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de aptámeros específicos para una histona de un organismo del género Leishmania que comprende

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de los 7 clones recuperados del screening mediante... [Seguir leyendo]

1. Un aptámero que comprende un ácido nucleico de cadena sencilla que es capaz de unirse específicamente a una histona de un organismo perteneciente al género Leishmania.

2. Un aptámero según la reivindicación 1 en el que la histona a la que se une el aptámero es la histona H2A.

3. Un aptámero según las reivindicaciones 1 ó 2 en el que el organismo perteneciente al género Leishmania es Leishmania infantum.

4. Un aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que el ácido nucleico es ADN.

5. Un aptámero según la reivindicación 4, en el que aptámero comprende una secuencia definida por la siguiente fórmula:

5'-GCGGATGAAGACTGGTGT-X-GCCCTAAATACGAGCAAC-3'

en donde X es un oligonucleótido seleccionado del grupo de SEQ ID NO: 8 a 14 o una variante funcionalmente equivalente del mismo.

6. Un aptámero según la reivindicación 4, en el que el aptámero comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1 a 7 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

7. Uso de un aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una mezcla de dichos aptámeros en un método in vitro para la detección de Leishmania.

8. Método de diagnóstico de una infección por Leishmania que comprende

9. Método según la reivindicación 8 en el que la infección por Leishmania es una leishmaniasis visceral, cutánea o mucocutánea.

10. Una composición farmacéutica que comprende al menos un aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 opcionalmente en combinación con uno o más soportes, excipientes o solventes farmacéuticamente aceptables.

11. Uso de al menos un aptámero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección por Leishmania.

12. Uso según la reivindicación 11 en el que la infección por Leishmania es una leishmaniasis visceral, cutánea o mucocutánea.