ANÁLISIS DE LAPSOS TEMPORALES DEL CICLO CELULAR DE NÚCLEOS NO TINCIONADOS.

Un procedimiento para hacer un seguimiento automáticamente de una fase del ciclo celular de una célula,

comprendiendo el procedimiento las etapas de: generar un volumen tridimensional espacio-temporal a partir de una serie de imágenes bidimensionales de una o más células tomadas en el transcurso del tiempo; y llevar a cabo un análisis por segmentación del volumen tridimensional para clasificar las una o más células en una fase G1, S, G2 o M del ciclo celular en el transcurso del tiempo, en el que la realización del análisis por segmentación comprende las etapas de: identificar tubos claros y oscuros dentro del volumen tridimensional; llevar a cabo una segmentación tridimensional usando conjuntos de nivel en los tubos oscuros para clasificar las células en una fase G2 del ciclo celular; y clasificar los tubos claros en fases G1, M o S del ciclo celular usando un análisis de enlace

Análisis de lapsos temporales del ciclo celular de núcleos no tincionados Antecedentes de la invención La presente técnica versa, en general, acerca de un análisis de imágenes diseñada para determinar la fase del ciclo celular de una célula particular. Más específicamente, la presente técnica versa acerca de la segmentación automática de una célula en una fase del ciclo celular usando una segmentación tridimensional de imágenes bidimensionales de lapsos temporales.

Cuando las células eucariotas se replican, pasan a través de una serie estrechamente regulada de eventos conocidos como ciclo celular. Generalmente, el ciclo celular incluye cuatro fases: G1, S, G2 y M. Cada fase del ciclo celular está marcada por características distintivas en la morfología celular y en el contenido total de ADN a medida que el ADN se replica y la célula se escinde en dos células hijas.

En labores de investigación básica y de descubrimiento de fármacos, puede obtenerse información valiosa entendiendo cómo un agente afecta al crecimiento y la división de las células. A menudo, esta información da alguna indicación del mecanismo de acción asociado con el compuesto. Por ejemplo, una clase particular de fármacos o de manipulaciones genéticas puede detener el crecimiento celular en la etapa G2 (segunda fase de intervalo) y puede actuar por medio de un conjunto particular de mecanismos o acciones. Otra clase de fármacos o de manipulaciones genéticas puede detener las células mientras realizan la mitosis y, así, pueden actuar por medio de un mecanismo diferente. La capacidad de determinar con rapidez si una población de células está bloqueada o detenida en la G2 o en la mitosis (o en alguna otra etapa) proporciona un instrumento valioso para evaluar el mecanismo de acción de un compuesto no caracterizado que haya sido sometido a ensayo en la población de células. Esto resulta particularmente útil en el estudio y el tratamiento del cáncer, dado que es deseable identificar compuestos que bloqueen la replicación de las células cancerosas de proliferación rápida sin perturbar a las células normales. Además, también es útil determinar si un compuesto no caracterizado tiene el efecto de aumentar el avance en el ciclo celular, porque tal compuesto puede ser potencialmente carcinogénico.

Típicamente, el avance del ciclo celular es evaluado por medio de un análisis de imágenes celulares fluorescentes. Tal análisis puede implicar tensionar células con una tinción nuclear, generalmente una tinción fluorescente, para identificar núcleos de células para proporcionar un punto de referencia para la segmentación celular y otros procedimientos de análisis de imágenes. El uso común de las tinciones fluorescentes presenta barreras para una formación de imágenes celulares a largo plazo. Por ejemplo, las tinciones nucleares dependen del ADN de una u otra forma para tincionar debidamente las células. Aunque tales tinciones pueden ser adecuadas para ensayos con células fijadas o para ensayos in vivo de corta duración (por ejemplo, varias horas) , las tinciones fluorescentes tienen efectos secundarios tóxicos que impiden los estudios a largo plazo. Si las células son tincionadas con una tinción celular y son cultivadas durante periodos prolongados, mueren, ya sea porque no pueden replicar su ADN cuando es objeto de intercalación con la tinción, o porque la tinción interfiere en la segregación de los cromosomas durante la mitosis.

Un procedimiento alternativo para tincionar núcleos y mantener las células con vida durante más de un ciclo celular es diseñar la célula para que exprese una proteína fluorescente como la Proteína Verde Fluorescente (GFP) que se acopla a una secuencia de localización nuclear para que la proteína actúe como una tinción nuclear. Aunque la tinción con GFP no interfiere en la replicación del ADN de la misma manera que la intercalación de tinciones fluorescentes, este enfoque implica la manipulación genética de las células. Además, este enfoque no distingue entre las diversas fases del ciclo celular. Más específicamente, un marcador de proteínas GFP puede tincionar células de forma diferencial en diversas fases de la mitosis (por ejemplo, profase, metafase, anafase y telofase) , pero el marcador no distingue entre las tres fases de la interfase: G1, S y G2.

Acton, S. T. et al.: “Data acceptance for Automated Leukocyte Tracking through Segmentation of Spatio-temporal Images”, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, vol. 52, nº 10, octubre de 2005, describe un procedimiento para efectuar el seguimiento de una fase del ciclo celular de una célula que incluye el uso de segmentación espaciotemporal para efectuar un seguimiento de los leucocitos y para extraer datos de velocidad de imágenes microscópicas de vídeo. El documento WO-A-2004/088573 describe un procedimiento de determinación de datos de la fase del ciclo celular que incluye la clasificación de las células en subpoblaciones, cada una de las cuales tiene células en diferentes fases del ciclo celular.

Además de procedimientos de tinción que no interfieran en el avance a largo plazo en el ciclo celular, existe la necesidad de una evaluación rápida y automática de tales células tincionadas. Dado que se realizan muchas investigaciones básicas y muchos descubrimientos de fármacos con un rendimiento elevado, es inviable la evaluación manual de imágenes de células tincionadas para los estudios a largo plazo. Por ejemplo, un ensayo celular puede tener varios cientos de células que pueden ser monitorizadas varias veces por hora durante varios días. Además, para cada agente o compuesto terapéutico potencial estudiado, pueden prepararse varios pocillos para proporcionar resultados estadísticamente significativos. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas que permitan una determinación fiable, precisa y automática del avance del ciclo celular.

Breve descripción En general, la presente invención versa acerca de técnicas de análisis de imágenes y de dispositivos que facilitan en análisis de imágenes. También versa acerca de medios legibles por máquina en los que se le proporcionan instrucciones, estructuras de datos, etc., para llevar a cabo los procedimientos de la invención. Según las presentes técnicas, pueden evaluarse imágenes de células mediante el uso de algoritmos específicos. Usando esas imágenes analizadas, los dispositivos de la presente invención pueden extraer conclusiones automáticamente en cuanto a la fase del ciclo celular de una célula en el transcurso del tiempo. Las presentes técnicas también pueden ser usadas para generar resultados de las imágenes procesadas, como árboles u otras visualizaciones apropiadas, que puedan representar gráficamente el avance de una o más células en el ciclo celular con el transcurso del tiempo.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para hacer un seguimiento automáticamente de una fase del ciclo celular de una célula, comprendiendo el procedimiento las etapas de: generar un volumen tridimensional espacio-temporal a partir de una serie de imágenes bidimensionales de una o más células tomadas en el transcurso del tiempo; y llevar a cabo un análisis por segmentación del volumen tridimensional para clasificar las una o más células en una fase G1, S, G2 o M del ciclo celular en el transcurso del tiempo, en el que la realización del análisis por segmentación comprende las etapas de: identificar tubos claros y oscuros dentro del volumen tridimensional; llevar a cabo una segmentación tridimensional usando conjuntos de nivel en los tubos oscuros para clasificar las células en una fase G2 del ciclo celular; y clasificar los tubos claros en fases G1, M o S del ciclo celular usando un análisis de enlace.

Según otro un aspecto de la presente invención, se proporciona un medio legible por ordenador para hacer un seguimiento automáticamente de una fase del ciclo celular de una célula que comprende: código para generar un volumen tridimensional espacio-temporal a partir de una serie de imágenes bidimensionales de una o más células tomadas en el transcurso del tiempo; y código para llevar a cabo un análisis por segmentación del volumen tridimensional para clasificar las una o más células en una fase G1, S, G2 o M del ciclo celular en el transcurso del tiempo, en el que el código para llevar a cabo el análisis por segmentación comprende: código para identificar tubos claros y oscuros dentro del volumen tridimensional; código llevar a cabo una segmentación tridimensional usando conjuntos de nivel en los tubos oscuros para clasificar... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para hacer un seguimiento automáticamente de una fase del ciclo celular de una célula, comprendiendo el procedimiento las etapas de: generar un volumen tridimensional espacio-temporal a partir de una serie de imágenes bidimensionales de una o más células tomadas en el transcurso del tiempo; y llevar a cabo un análisis por segmentación del volumen tridimensional para clasificar las una o más células en una fase G1, S, G2 o M del ciclo celular en el transcurso del tiempo, en el que la realización del análisis por segmentación comprende las etapas de: identificar tubos claros y oscuros dentro del volumen tridimensional; llevar a cabo una segmentación tridimensional usando conjuntos de nivel en los tubos oscuros para clasificar las células en una fase G2 del ciclo celular; y clasificar los tubos claros en fases G1, M o S del ciclo celular usando un análisis de enlace.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la realización del análisis de enlace comprende una métrica de distancia euclídea para identificar una célula hija de las una o más células.

3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2 en el que la realización del análisis de enlace comprende un procedimiento de marcha rápida para identificar una célula hija de las una o más células.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que las una o más células están marcadas con un agente de formación de imágenes.

5. El procedimiento de la reivindicación 4 en el que el agente de formación de imágenes comprende un marcador celular dinámico adaptado para cambiar de posición en la célula durante el avance del ciclo celular.

6. Un medio legible por ordenador para hacer un seguimiento automáticamente de una fase del ciclo celular de

una célula que comprende: código para generar un volumen tridimensional espacio-temporal a partir de una serie de imágenes bidimensionales de una o más células tomadas en el transcurso del tiempo; y código para llevar a cabo un análisis por segmentación del volumen tridimensional para clasificar las una o más células en una fase G1, S, G2 o M del ciclo celular en el transcurso del tiempo, en el que el código para llevar a cabo el análisis por segmentación comprende: código para identificar tubos claros y oscuros dentro del volumen tridimensional; código llevar a cabo una segmentación tridimensional usando conjuntos de nivel en los tubos oscuros para clasificar las células en una fase G2 del ciclo celular; y código para clasificar los tubos claros en fases G1, M o S del ciclo celular usando un análisis de enlace.

7. El medio legible por ordenador de la reivindicación 6 en el que el código para llevar a cabo el análisis de enlace comprende código para una métrica de distancia euclídea para identificar una célula hija de las una o más 30 células.

8. El medio legible por ordenador de las reivindicaciones 6 o 7 en el que el código para llevar a cabo el análisis de enlace comprende código para un procedimiento de marcha rápida para identificar una célula hija de las una o más células.