UTILIZACIÓN DE CONJUGADOS CON CONECTORES CORTABLES MEDIANTE FOTODISOCIACIÓN O FRAGMENTACIÓN PARA EL ANÁLISIS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE LAS SECCIONES DE TEJIDO.

Utilización de conjugados con conectores cortables mediante fotodisociación o fragmentación para el análisis de espectrometría de masas de las secciones de tejido. La invención se refiere a un método para determinar por lo menos un mapa de una molécula diana en una sección de tejido, utilizando por lo menos un conjugado (A-X)n-B, en el que A es una molécula de etiqueta de peso molecular conocido, X es un conector que es fotocortable a la longitud de onda de un láser MALDI, n es un número entero de por lo menos 1, y B es una molécula de unión que se une específicamente a dicha molécula diana. Al utilizar la espectrometría de masas MALDI, dicha molécula conectora X puede cortarse mediante fotodisociación durante la irradiación con láser de la muestra en el caso de que sea fotocortable a la longitud de onda de dicho láser MALDI. Recientemente, algunos estudios de transcriptoma y de proteoma han conducido a la identificación de muchas proteínas implicadas en una amplia diversidad de enfermedades, tales como varios tipos de cáncer. Sin embargo, la mayoría de estos resultados se han obtenido en muestras de ácidos nucleicos o proteínas extraídos y purificados, que no generan información sobre la localización de tejido de las proteínas implicadas, aunque este tipo de información resulta crucial para la comprensión de los procesos fisiológicos. Otra desventaja de la mayoría de los datos disponibles es que pocos estudios han analizado simultáneamente el ARNm y la expresión de proteínas de las moléculas de interés, lo que, sin embargo, resulta importante para clarificar el patrón de expresión de una proteína particular. De esta manera, resultaría muy útil disponer de datos combinados de mapas tanto ARNm como de expresión de proteínas. Las técnicas actuales para el mapeado de expresión en tejidos del ARNm habitualmente recurren a sondas de ácidos nucleicos acoplados a marcadores radioactivos, fluorescentes o quimioluminiscentes tras la hibridación in situ (ISH). Para el mapeado de la expresión de proteínas en secciones de tejido, las técnicas habituales comprenden la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia. La desventaja principal de todas dichas técnicas de mapeado de expresión de secciones de tejidos es que el número de moléculas diana que pueden analizarse simultáneamente es limitado, incluso con sondas fluorescentes o anticuerpos, debido a no pueden estudiarse más de 3 ó 4 moléculas diana diferentes en el mismo experimento. Por otra parte, la espectrometría de masas permite el análisis multiplex simultáneo de mezclas complejas de moléculas biológicas dependiendo de su peso molecular. En particular, la espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) se ha convertido en una potente herramienta en el campo de la investigación biológica y se utiliza para la detección, identificación y caracterización de ácidos nucleicos, péptidos y proteínas en mezclas complejas. En particular, Olejnik y colaboradores describen la síntesis y caracterización de conjugados fotocortables de péptido- ADN conjuntamente con su utilización como sondas de hibridación de marcador de masa fotocortable (PCMM) para la detección de ADNs diana sintéticos inmovilizados mediante espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI) (Olejnik et al., Nucleic Acids Res. 27(23):4626-31, 1 de diciembre de 1999). La solicitud de patente WO nº 98/26095 describe la síntesis y utilización de compuestos de marcado de masa para interactuar específicamente con dianas moleculares biológicas. La solicitud de patente WO nº 00/68434 describe un método para detectar múltiples analitos en una muestra en un único ensayo, basado en la codificación de las moléculas diana con señales, seguido de la descodificación de la señal codificada. Sin embargo, ningún documento de la técnica anterior describe un método para el análisis de espectrometría de masas MALDI (MALDI-MS) de ácidos nucleicos comprendidos en secciones de tejido. Se ha creado en el contexto de la presente invención un nuevo método para la detección de moléculas biológicas, en particular de ARNm, en secciones de tejido mediante MALDI-MS, utilizando conjugados compuestos de un grupo que se une específicamente a la molécula o moléculas diana, un grupo de peso molecular conocido (el grupo "etiqueta") y un conector fotocortable que el láser MALDI corta directamente durante el procedimiento de ionización (ver la figura 1). Este nuevo método permite el mapeado indirecto fácil y preciso del ARNm en secciones de tejido, y la utilización de grupos de etiqueta de pesos moleculares muy diferentes permite analizar un número elevado de moléculas biológicas diferentes simultáneamente. Además, al utilizar este nuevo método para mapear la expresión en tejidos del ARNm, puede obtenerse una representación común del ARNm y de la expresión de la proteína correspondiente en dos secciones consecutivas de tejido. De hecho, varias publicaciones han demostrado que el MALDI-MS podría convertirse en una eficiente herramienta para el análisis directo de péptidos y proteínas de secciones de tejido (Caprioli R.M., Farmer T.B., Gile J., Anal. Chem. 69:4751-4760, 1997; Stoeckli M., Farmer T.B., Caprioli R.M., Nat. Med. 7:493-496, 2001; Chaurand P., Schwartz S.A., Caprioli R.M., Anal. Chem. 87A-93A, 2004). 2 E06795326 04-11-2011   De esta manera, la invención se refiere a un método para determinar por lo menos un mapa de una molécula diana en una sección de tejido, comprendiendo: a) hibridar dicha sección de tejido con por lo menos un conjugado (A-X)n-B, en el que: - A es una molécula de etiqueta de peso molecular conocido, - X es un conector que es fotocortable a la longitud de onda de un láser MALDI, - n es un número entero igual o superior a 1, - B es una molécula de unión que se une específicamente a dicha molécula diana, y cada molécula B diferente se une a una molécula A de etiqueta diferente, b) escanear la superficie de la sección de tejido y análisis de cada punto contiguo con un espectrómetro de masas MALDI, en el que el láser MALDI se utiliza tanto para liberar la molécula A de etiqueta como para inducir la ionización de la muestra, y en el que se guardan los datos resultantes de cada punto, y c) análisis de los datos obtenidos en la ventana o ventanas de masa molecular de cada molécula de etiqueta diferente con el fin de crear tantos mapas de la sección de tejido como moléculas de etiqueta estudiadas diferentes. Según la invención, una "sección de tejido" preferentemente presenta las propiedades siguientes: puede congelarse o incluirse en parafina, su grosor preferentemente es del orden de un diámetro de célula de mamífero, estando comprendido, de esta manera, entre 5 y 20 µm. En el caso de una sección congelada obtenida a partir de un tejido congelado utilizando un criostato, preferentemente se utiliza un OCT (polímero de temperatura de corte óptima) únicamente para fijar el tejido, pero el tejido congelado no se incluye en OCT, de manera que las secciones de tejido no entren en contacto con el OCT. A continuación, la sección de tejido puede transferirse a una placa MALDI compuesta de cualquier material adecuado para el análisis MALDI posterior, incluyendo metales, materiales inorgánicos u orgánicos, tales como oro, acero, fibra de vidrio, vidrio, nilón 6/6, silicio, plástico, polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno o una sección de vidrio de cualquier grosor recubierta de metal conductor que mantenga las propiedades de transparencia, tal como níquel o ITO. Según la invención, una "molécula diana" se refiere a una molécula de interés que puede unirse específicamente a otra molécula, denominada "molécula de unión". Dichas moléculas diana/de unión en tándem pueden mostrar cualquier química, con la condición de que puedan generar una hibridación específica en una sección de tejido. Una gran diversidad de moléculas diana/de unión en tándem, así como de moléculas de unión/diana en tándem, se encuentra comprendida dentro del alcance de la presente invención, incluyendo ácidos nucleicos/ácidos nucleicos, ácidos nucleicos/péptidos, ácidos nucleicos/proteínas, ácidos nucleicos/anticuerpos, péptidos/péptidos, péptidos/proteínas, péptidos/anticuerpos, proteínas/proteínas (en particular ligandos/receptores), proteínas/azúcares, antígenos/anticuerpos, haptenos/anticuerpos, compuestos orgánicos/receptor (ver algunos ejemplos en la figura 2). En particular, las secuencias de ácidos nucleicos diana pueden detectarse específicamente utilizando sondas de ácidos nucleicos de una cadena con una secuencia de ácidos nucleicos que sea complementaria al ácido nucleico diana de una cadena o a las cadenas de un ácido nucleico diana de doble cadena... [Seguir leyendo]

1. Método para determinar un mapa de por lo menos una molécula diana en una sección de tejido, que comprende: a) hibridar dicha sección de tejido con por lo menos un conjugado (A-X)n-B, en el que: - A es una molécula de etiqueta de peso molecular conocido, - X es un conector que es fotocortable a la longitud de onda de un láser MALDI, - n es un número entero de por lo menos 1, - B es una molécula de unión que se une específicamente a dicha molécula diana, y - cada molécula B diferente es conectada a una molécula de etiqueta A diferente, b) escanear la superficie de la sección de tejido y analizar cada punto adyacente con un espectrómetro de masas MALDI, en el que el láser MALDI se utiliza tanto para liberar la molécula de etiqueta A como para inducir la ionización de la muestra, y en el que los datos resultantes de cada punto se guardan; y c) analizar los datos obtenidos en la ventana o ventanas de masa molecular de cada molécula de etiqueta diferente con el fin de crear tantos mapas de la sección de tejido como el número de moléculas diana estudiadas diferentes. 2. Método según la reivindicación 1, en el que cada molécula diana se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos, en particular moléculas de ARNm, péptidos, proteínas, en particular receptores y ligandos, anticuerpos, antígenos, aptámeros, haptenos y compuestos orgánicos. 3. Método según la reivindicación 2, en el que por lo menos una molécula diana es una molécula de ARNm. 4. Método según la reivindicación 2, en el que por lo menos una molécula diana es un péptido, una proteína, un antígeno o un hapteno. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que cada molécula B que se une específicamente a una molécula diana se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos, péptidos, proteínas, en particular receptores y ligandos, anticuerpos, antígenos, haptenos y compuestos orgánicos. 6. Método según la reivindicación 5, en el que cada molécula B que se une específicamente a un ácido nucleico diana es una sonda de ácidos nucleicos con una secuencia que es complementaria a dicha secuencia de ARNm diana. 7. Método según la reivindicación 5, en el que cada molécula B que se une específicamente a un péptido, proteína, antígeno o hapteno diana es un anticuerpo dirigido contra dicho péptido, proteína, antígeno o hapteno. 8. Método según cualquiera de la reivindicaciones 1 a 7, en el que cada molécula de etiqueta A se selecciona de entre el grupo constituido por péptidos, ácidos nucleicos, azúcares, polímeros, lípidos y compuestos orgánicos. 9. Método según la reivindicación 8, en el que por lo menos una molécula de etiqueta A es un péptido. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula conectora X comprende una fracción seleccionada de entre el grupo constituido por: 27 E06795326 04-11-2011 y en el que R es un grupo alquilo C1-C6 y m es un número entero comprendido entre 1 y 4. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula conectora X comprende una fracción seleccionada de entre el grupo constituido por: y   28 E06795326 04-11-2011   12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula o moléculas diana son moléculas de ARNm, la molécula o moléculas de unión B son sondas de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a las secuencias de ARNm, la molécula o moléculas de etiqueta A son péptidos, n es 1 y el conjugado o conjugados (A-X)-B presentan la estructura siguiente: 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula o moléculas diana son moléculas de ARNm, la molécula o moléculas de unión B son sondas de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a las secuencias de ARNm, la molécula o moléculas de etiqueta A son péptidos, n es 1 y el conjugado o conjugados (A-X)-B presentan la estructura siguiente: 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula o moléculas diana son moléculas de ARNm, la molécula o moléculas de unión B son sondas de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a las secuencias de ARNm, la molécula o moléculas de etiqueta A son péptidos, n es superior a 1 y la sonda o sondas de ácidos nucleicos comprenden por lo menos una base modificada de la estructura siguiente: 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula o moléculas diana son moléculas de ARNm, la molécula o moléculas de unión B son sondas de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a las secuencias de ARNm, la molécula o moléculas de etiqueta A son péptidos, n es superior a 1 y la sonda o sondas de ácidos nucleicos comprenden por lo menos una base modificada de la estructura siguiente: 29 E06795326 04-11-2011   16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que se mapean por lo menos 5 moléculas de ARNm diferentes en la sección de tejido. 17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, que comprende además una etapa d) que consiste en analizar los datos obtenidos en las ventanas de masa molecular de cada proteína correspondiente a cada molécula de ARNm con el fin de crear el mapa de expresión de cada proteína correspondiente de la sección de tejido. 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la molécula o moléculas diana son uno o más péptidos, proteínas o haptenos, la molécula o las moléculas de unión B son anticuerpos dirigidos contra dichas moléculas diana, la molécula o las moléculas de etiqueta A son péptidos, n es 1 y el conjugado o los conjugados (A- X)-B presentan la estructura siguiente: E06795326 04-11-2011   31 E06795326 04-11-2011   32 E06795326 04-11-2011   33 E06795326 04-11-2011   34 E06795326 04-11-2011   E06795326 04-11-2011   36 E06795326 04-11-2011   37 E06795326 04-11-2011   38 E06795326 04-11-2011   39 E06795326 04-11-2011   E06795326 04-11-2011