LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR ENFERMEDADES NEOPLASICAS EN LOS CUALES SE EMPLEAN TRATAMIENTOS TERAPEUTICOS GENETICOS EN COMBINACION CON UN REGIMEN DE QUIMIOTERAPIA.

UNA TERAPIA COMBINACIONAL CON AGENTES ALQUILATANTES ANTINEOPLASICOS OPTIMIZARA LA SENSIBILIDAD HACIA LOS TUMORES ANFITRIONES DE ESTOS AGENTES UTILIZADOS SOLOS O EN COMBINACION CON O 6 -BENZILGUANINA (BG) O UN COMPUESTO O UNOS COMPUESTOS SIMILARES. LAS CELULAS HAMATOPOIETICAS SON INFECTADAS CON UN TRANSGEN QUE EXPRESA UNA PROTEINA AGT MUTANTE QUE EXHIBE ACTIVIDAD DE REPARACION DEL ADN MIENTAS QUE IMPARTE RESISTENCIA A LA BG O A UN COMPUESTO RELACIONADO. LA INTRODUCCION DE POBLACIONES DE CELULAS HEMATOPOIETICAS TRANSDUCIDAS QUE EXPRESAN LA PROTEINA AGT MUTANTE EN EL PACIENTE JUNTO CON EL REGIMEN QUIMIOTERAPEUTICO REDUCIRA SUBSTANCIALMENTE LA MIELOSUPRESION TRADICIONALMENTE ASOCIADAS CON LA ADMINISTRACION DE ESTAS DROGAS ANTINEOPLASICAS

1. INTRODUCCIÓN

La presente revelación se refiere al tratamiento de una enfermedad neoplásica en la que los tratamientos de terapia genética se emplean en combinación con un régimen de quimioterapia. Más específicamente, esta terapia de combinación optimizará la sensibilidad del huésped del tumor a los agentes alquilantes y metilantes utilizados 5 individualmente o conjuntamente con 06-bencilguanina (BG) o un compuesto o compuestos similares. La BG inhibe la 06-alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT) humana de tipo salvaje, una proteína de reparación de DNA conocida por obviar los efectos antineoplásicos de los agentes alquilantes. Las células hematopoyéticas se infectan con un transgén que expresa una proteína AGT mutante que exhibe una actividad reparadora de DNA, al tiempo que imprime resistencia a la BG o a un compuesto relacionado. La introducción de la población de células hematopoyéticas transducidas que 10 expresan la proteína AGT mutante en el paciente junto con el régimen quimioterapéutico reducirá de forma sustancial la mielosupresión tradicionalmente asociada con la administración de estos fármacos antineoplásicos.

La presente revelación también incluye métodos de selección dominante de un segundo gen transducido en células hematopoyéticas en las que un primer gen transducido que expresa un mutante de AGT resistente a un derivado de la 06-bencilguanina es cocultivado en presencia del derivado de la 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante. 15 Una mejora marcada de la supervivencia clonogénica de las células CD34* transducidas con el transgén que expresa G156A AGT en presencia de BG y BCNU demuestra que cualquier mutante de AGT que registre una actividad similar será útil como gen de resistencia al fármaco.

2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los agentes alquilantes y metilantes son grupos de compuestos importantes para la quimioterapia contra el 20 cáncer. Los agentes cloroetilantes, incluyendo, a título meramente enunciativo, las cloroetilnitrosureas, forman aductos de DNA dentro de los núcleos de las células que promueven alternaciones en la estructura y/o la función del DNA. Estos cambios a nivel del DNA provocan una citotoxicidad dentro de la célula seleccionada.

Las cloroetilnitrosureas, como BCNU (N,N'-bis (2-cloroetil)-N-nitrosurea)y CCNU (N-(2-cloroetil)-3-ciclohexil-N-nitrosourea), son compuestos solubles en lípidos que han demostrado poseer una utilidad clínica contra algunas 25 neoplasias, aunque con un éxito limitado en los ensayos clínicos. Estas cloroetilnitrosureas promueven la alquilación del DNA en la posición 06 de la guanina, provocando un enlace cruzado entre las cadenas de DNA y una fidelidad alterada de la replicación y transcripción del DNA. Este enlace cruzado entre las cadenas implica la formación de un aducto de cloroetilo en el residuo de guanina que se somete a una reorganización intramolecular para producir un intermedio inestable que reacciona con el residuo de citosina de la cadena cruzada. El resultado es un enlace cruzado N1-guanina, 30 N3-citosina-etanol.

Este enlace cruzado N1-guanina, N3-citosina-etanol se puede prevenir mediante la proteína de reparación de DNA 06 -alquilguanina-DNA alquiltransferasa (AGT). Esta proteína de reparación es activa en las células tumorales de mamíferos y es responsable de proteger a las células frente a los efectos antitumorales normalmente asociados a los agentes cloroetilantes, como BCNU y CCNU. AGT tiene un mecanismo de acción único en el sentido de que provoca la 35 transferencia de los grupos de alquilos presentes en la posición 06 de la guanina en el DNA hacia un residuo de cisteína ubicado dentro de la secuencia de aminoácidos de AGT (Lindahl. et al., 1988, Annu. Rev. Biochem. 57: 133-157; Pegg, 1990, Cancer Res. 50: 6119-6129). La proteína AGT resultante, que contiene S-alquilcisteína, no se transmite de nuevo a la cisteína. La AGT actúa solamente una vez y el número de residuos de O6-alquilguanina que se puede reparar es igual al número de moléculas de AGT disponibles. Así pues, las células tumorales que expresan unos elevados niveles 40 de AGT muestran resistencia a los fármacos quimioterapéuticos alquilantes y metilantes, lo que puede limitar la efectividad clínica de estos agentes. A tal efecto, una reducción de la AGT funcional en las células tumorales de mamíferos debería estar correlacionada con un incremento de la sensibilidad de estas células a los efectos quimioterapéuticos de los agentes cloroetilantes que forman aductos de DNA en la posición O° de la guanina.

La patente estadounidense nº 5.091.430 expedida para Moschel et al. el 24 de febrero de 1992 revela 45 compuestos de guanina O6 sustituida que inhiben la AGT. Un compuesto ejemplificado que inhibe la AGT es la 06-benciguanina (BG). Se ha demostrado que BG es un inactivador, altamente dependiente del tiempo y de la concentración, de la AGT humana (Dolan. et al.. 1990. Proc.Natl. Acad. Sci. 87: 686-690). Este mecanismo ha sido confirmado mediante la identificación de S-bencilcisteína en la AGT y la formación de cantidades estequiométricas de guanina tras la incubación con BG. 50

La patente estadounidense nº 5.352.669 expedida para Moschel. et al. el 4 de octubre de 1994 revela compuestos de guanosina O6 sustituida y 2' desoxiguanosina que se ha demostrado que inhiben la AGT.

La patente estadounidense nº 5.358.952 expedida para Moschel, et al. el 22 de octubre de 1994 revela combinaciones farmacéuticas para la quimioterapia que comprenden guanina 06 sustituida conjuntamente con agentes alquilantes antineoplásicos.

Una importante limitación del uso de los agentes alquilantes y metilantes en el tratamiento de la enfermedad neoplásica es la profunda mielosupresión producida por estos fármacos. Este problema alcanza su cota máxima unas 4-5 6 semanas después del tratamiento y, de este modo, impide la repetición de una terapia cíclica a intervalos preferibles. La mielo supresión se debe a las reducidas concentraciones de AGT en las células hematopoyéticas.

Crone y Pegg (1993. Cancer Res. 53: 4750-4753) revelan una proteína AGT humana mutante con un único cambio de aminoácidos de la prolina a la alanina en aa #140 (P140A). Esta AGT humana mutante muestra una reducción de la sensibilidad a BG in vitro. Los autores no abordan la actividad in vivo de esta mutante con respecto a BG o a las 10 combinaciones de BG/BCNU.

Crone, et al. (1994, Cancer Res. 53: 4750-4753) revelan una proteína AGT humana mutante adicional con un único cambio de aminoácidos de la glicina a la alanina en aa #156 (G156A). Como en el caso de la AGT P140A humana, la G156A muestra una reducción de la sensibilidad a BG in vitro. Una vez más, los autores no abordan la actividad in vivo de esta mutante con respecto a BG o a las combinaciones de BG/BCNU. 15

Gerson, et al. (1994, Mutation Res. 307:541-555) revela un ratón transgénico que expresa bien cDNA de O6-metilguanina-DNA metiltransferasa (MGMT) humana de tipo salvaje o bien el gen ada bacteriano (que expresa una versión procariótica de AGT resistente a BG). El autor muestra un nivel de protección contra la adición de BCNU en los tipos de células transformados que ha resultado expresar el respectivo gen.

Otra forma de abordar la toxicidad del agente alquilante es la terapia genética. Moritz. et al. (1995. Cancer Res. 20 55:2608-2614) revela la expresión mediada por retrovirales de la MGMT en células medulares murinas. Los autores utilizaron un fuerte promotor para intentar sobreexpresar la MGMT en estas células en un esfuerzo por superar el efecto de la BCNU añadida para los estudios in vitro e in vivo. Los autores no hicieron ningún intento ni sugirieron la inhibición de la MGMT en el sitio del tumor y proporcionaron una forma resistente de la proteína en las células hematopoyéticas, al objeto de reducir la mielosupresión inducida por la BCNU. Allay, et al. (1995. Blood 85: 3342:-3351-2614) también 25 demuestra la expresión mediada por retrovirales de la MGMT en células medulares murinas. Los autores utilizaron el vector MPSV con el fragmento del promotor 5'LTR para incrementar la expresión de MGMT y obtener también una reducción in vitro de la mielosupresión inducida por BCNU. Harris, et al. (1995, Proc. Amer. Assoc. Can. Res. 36: 419) revela la expresión mediada por retrovirales de un gen ada bacteriano y una medida de resistencia a las nitrosureas. Los autores señalaron un aumento de la resistencia a BG y BCNU in vivo. Maze, et al. (1996, Proc Natl. Acad. Sci. 93: 206-30 210) revela la expresión in vitro...

1. La combinación de:

(a) un compuesto capaz de inactivar la 06-alquilguanina-DNA- alquiltransferasa expresada en las células tumorales, y

(b) células de mamífero no malignas dotada de un transgén ex vivo que expresan una proteína 06-alquilguanina-DNA-alquiltransferasa mutante humana que imprime resistencia a dicho compuesto, al tiempo que conservan la actividad para la función inhibida en las células tumorales, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica en la que la 5 combinación se utilizará conjuntamente con un régimen quimioterapéutico.

2. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1, donde dicho régimen de quimioterapia incluye un agente alquilante o metilante antineoplásico.

3. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 2 donde dichas células no malignas son células hematopoyéticas. 10

4. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1, donde dicho compuesto es 2-desoxirribosa-06-bencilguanina, análogo de 2'-desoxirribonucleósido de la O6-bencilguanina.

5. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1 donde dicho compuesto es un derivado de pirimidina.

6. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1 donde dicho compuesto es un derivado de 06-bencilguanina. 15

7. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 6 donde dicho derivado bencilado de la guanina es 06-bencilguanina.

8. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 3 donde dichas células hematopoyéticas son transducidas con MFG-hAGT/P140A.

9. La combinación que se utilizará conforme a la Afirmación 1 donde dichas células hematopoyéticas son transducidas 20 con MFG-hAGT/G156A (∆MGMT).

10. Un método de fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica en un huésped mamífero, complementando los agentes alquilantes antineoplásicos, cuyo método comprende:

(a) transducción de una población de células madre hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas recogidas de un huésped con un vector recombinante que contiene una secuencia de ácido nucleico que expresa una proteína 06-25 alquilguanina-DNA-alquiltransferasa mutante humana que imprime resistencia a los compuestos de O6-bencilguanina, resultando en células hematopoyéticas transducidas;

(b) adición de un compuesto de 06-bencilguanina a un régimen de quimioterapia, inactivando dicho compuesto una proteína 06-alquilguanina-DNA alquiltransferasa expresada en las células tumorales;

donde el huésped puede ser tratado mediante la introducción de dichas células hematopoyéticas transducidas 30 en dicho huésped mamífero, e introducción de dicho régimen de quimioterapia en el huésped mamífero, de forma que la expresión de dicha proteína mutante imprima resistencia al mencionado compuesto de 06-bencilguanina, al tiempo que conserve la actividad de tipo salvaje para la función inhibida en las células tumorales.

11. El método de la Afirmación 10 donde dicho huésped mamífero es un humano.

12. El método de la Afirmación 10 donde dichas células hematopoyéticas son células CD34* enriquecidas de la sangre 35 periférica.

13. El método de la Afirmación 10 donde dicho compuesto de guanina bencilada es 06-bencilguanina.

14. El método de la Afirmación 12 o la Afirmación 13 donde dicho vector recombinante es MFG-hAGT/P 140A.

15. El método de la Afirmación 12 o la Afirmación 13 donde dicho vector recombinante es MFG-hAGT/G 156A (AMGMT). 40

16. Un método ex vivo de selección dominante de un segundo gen transducido en las células transducidas que comprende:

(a) transducción de un primer gen que expresa un mutante conocido de alquilguanina-DNA-alquiltransferasa resistente a un derivado de O6-bencilguanina en las células diana;

(b) transducción de un segundo gen en las células diana;

(c) cocultivo de la población transducida de las células diana en presencia de un derivado de 06-bencilguanina y un agente alquilante o metilante, 5

(d) donde la células supervivientes contienen el segundo gen.