TRIGO CON ACTIVIDAD DE ENZIMA RAMIFICANTE Y ALMIDÓN ALTERADOS Y PRODUCTOS QUE CONTIENEN ALMIDÓN DERIVADOS DEL MISMO.

Trigo con actividad de enzima ramificante y almidón alterados y productos que contienen almidón derivados del mismo. Campo de la invención La presente invención se refiere a una planta del trigo que presenta un grano de almidón con un contenido de amilosa relativamente elevado. Asimismo, la invención se refiere al trigo con una actividad reducida de enzima IIa ramificador del almidón (SBEIIa) en el endospermo y a los procedimientos para obtener estas plantas. La invención se refiere asimismo al grano y al almidón y a los productos alimenticios y no alimenticios obtenidos a partir de los mismos. Antecedentes de la invención En los cereales, el almidón constituye aproximadamente 45% a 65% del peso del grano maduro. El almidón está compuesto de dos tipos de molécula: la amilosa y la amilopectina. La amilosa es una molécula esencialmente lineal compuesta de cadenas glucosídicas unidas por enlaces -1,4, mientras que la amilopectina es muy ramificada, con enlaces glucosídicos -1,6 que unen cadenas lineales. La síntesis del almidón en el endospermo de las plantas superiores la realiza un conjunto de enzimas que cataliza cuatro etapas clave. En primer lugar, la ADP-glucosa pirofosforilasa activa el monómero precursor del almidón a través de la síntesis de la ADP-glucosa a partir de G-1-P y ATP. En segundo lugar, el donador glucosilo activo, la ADP-glucosa, es transferida al extremo no reductor de un enlace -1,4 preexistente por almidón sintasas. En tercer lugar, los enzimas ramificadores del almidón introducen puntos de ramificación mediante el corte de una región de glucano unido con enlaces -1,4, seguido de la transferencia de la cadena cortada a una cadena aceptora, formando un nuevo enlace -1,6. Los enzimas ramificadores del almidón son los únicos enzimas que pueden introducir enlaces -1,6 en los -poliglucanos y, por lo tanto, desempeñan un papel esencial en la formación de la amilopectina. Finalmente, los enzimas desramificadores del almidón eliminan algunos de los enlaces de ramas, aunque todavía no se ha determinado cuál es el mecanismo mediante el que actúan (Myers et al., 2000). Aunque resulta claro que resultan necesarias por lo menos dichas cuatro actividades para la síntesis normal del gránulo de almidón en las plantas superiores, se encuentran múltiples isoformas de cada una de las cuatro actividades en el endospermo de las plantas superiores y se han propuesto funciones específicas para las isoformas individuales basándose en el análisis mutacional (Wang et al., 1998; Buleon et al., 1998) o mediante la modificación de los niveles de expresión génica utilizando enfoques transgénicos (Abel et al., 1996; Jobling et al., 1999; Schwall et al., 2000). Sin embargo, las contribuciones exactas de cada isoforma de cada actividad a la biosíntesis del almidón todavía no se conocen, y no se conoce si estas contribuciones difieren marcadamente entre especies. En el endospermo del cereal, se encuentran presentes dos isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa, una forma dentro del amiloplasto, y una forma en el citoplasma (Denyer et al., 1996; Thorbjornsen et al., 1996). Cada forma está compuesta de dos tipos de subunidad. Los mutantes shrunken (sh2) y brittle (bt2) en el maíz representan lesiones en las subunidades grande y pequeña, respectivamente (Giroux y Hannah, 1994). Se encuentran cuatro clases de almidón sintasa en el endospermo del cereal, una isoforma localizada exclusivamente dentro del gránulo de almidón, la almidón sintasa unida al gránulo (GBSS), dos formas que se distribuyen entre el gránulo y la fracción soluble (SSI, Li et al., 1999a; SSII, Li et al., 1999b) y una cuarta forma que se encuentra enteramente localizada en la fracción soluble, SSIII (Cao et al., 2000; Li et al., 1999b; Li et al., 2000). Se ha demostrado que la GBSS resulta esencial para la síntesis de la amilosa (Shure et al., 1983), y las mutaciones en SSII y en SSIII se ha demostrado que alteran la estructura de la amilopectina (Gao et al., 1998; Craig et al., 1998). No se han descrito mutaciones que definan un papel para la actividad de SSI. Se expresan tres formas de enzima ramificador en el endospermo del cereal, el enzima ramificador I (SBEI), el enzima ramificador IIa (SBEIIa) y el enzima ramificador IIb (SBEIIb) (Hedman y Boyer, 1982; Boyer y Preiss, 1978; Mizuno et al., 1992; Sun et al., 1997). Se han caracterizado secuencias genómicas y de ADNc para el arroz (Nakamura y Yamanouchi, 1992), el maíz (Baba et al., 1991; Fisher et al., 1993; Gao et al., 1997) y el trigo (Repellin et al., 1997; Nair et al., 1997; Rahman et al., 1997). La alineación de secuencias revela un grado elevado de similitud de secuencias a nivel tanto de nucleótidos como de aminoácidos y permite el agrupamiento en las clases SBEI, SBEIIa y SBEIIb. Las clases SBEIIa y SBEIIb generalmente muestran una identidad de secuencia de aproximadamente 80%, particularmente en las regiones centrales de los genes. SBEIIa y SBEIIb también pueden distinguirse por sus patrones de expresión. SBEIIb generalmente se expresa específicamente en el endospermo, mientras que SBEIIa se encuentra presente en todos los tejidos de la planta. En el endospermo del trigo, se encuentra SBEI (Morell et al., 1997) exclusivamente en la fracción soluble, mientras que SBEIIa y SBEIIb se encuentran en las fracciones tanto soluble como asociada al gránulo de almidón (Rahman et al., 1995). En el maíz y el arroz se ha demostrado que los fenotipos de amilosa elevada resultan de lesiones en el gen SBEIIb, también conocido como el gen extensor de amilosa (ae) (Boyer y Preiss, 1981; Mizuno et al., 1993; Nishi et al., 2001). En estos mutantes de SBEIIb, los granos de almidón del endospermo mostraban una morfología 2   anormal, el contenido de amilosa se encontraba significativamente elevado y la frecuencia de ramificación de la amilopectina residual se encontraba reducida y la proporción de cadenas cortas ([Seguir leyendo]

1. Grano obtenido a partir de una planta del trigo, que comprende almidón, en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%, comprendiendo dicho grano un nivel reducido de la proteína SBEIIa, actividad de enzima SBEIIa o ambos en el endospermo en comparación con el grano de tipo salvaje, y que comprende una variación genética que conduce a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o de ambos, respecto al grano de tipo salvaje, comprendiendo dicha variación genética una mutación en un gen SBEIIa o un ácido nucleico introducido que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa en el que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa. 2. Grano según la reivindicación 1, en el que el nivel de la proteína SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa o de ambas en el endospermo se encuentra reducido en por lo menos 50% respecto al grano de tipo salvaje. 3. Grano según la reivindicación 1 ó 2, en el que la variación genética comprende una mutación en un gen SBEIIa que conduce a un nivel reducido de la proteína SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa o de ambos en el endospermo respecto al grano de tipo salvaje. 4. Grano según la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende una mutación nula en por lo menos un gen SBEIIa. 5. Grano según la reivindicación 4, en el que la planta es hexaploide y el grano comprende mutaciones nulas en dos o tres genes SBEIIa. 6. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un nivel reducido de la proteína SBEIIb, de actividad enzimática o de ambas respecto al grano de tipo salvaje. 7. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende una mutación en el que el gen SBEIIa se encuentra ausente del brazo largo del cromosoma 2A o en el que el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a unas proteína SBEIIa, actividad del enzima SBEIIa reducidas o a ambas, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. 8. Grano según la reivindicación 7, en el que la mutación es una mutación nula del gen SBEIIa. 9. Grano según la reivindicación 7 ó 8, en el que el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a unas proteína SBEIIa, actividad del enzima SBEIIa reducidas, o a ambas, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje, y en el que dicha mutación es una deleción de parte del gen SBEIIa. 10. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además una mutación en el que el gen SBEIIb se encuentra ausente del brazo largo del cromosoma 2A o en el que el gen SBEIIb en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a unas proteína SBEIIb, actividad del enzima SBEIIb reducidas, o a ambas, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. 11. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la deleción interrumpe la expresión de tanto el gen SBEIIa como el gen SBEIIb en el brazo largo del cromosoma 2A. 12. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la planta es una planta de trigo durum. 13. Grano según la reivindicación 12, que comprende además una variación genética que conduce a una actividad de enzima ramificador del almidón reducida codificada por el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2B respecto al grano de tipo salvaje, en el que dicha variación genética comprende una ausencia de gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2B o una mutación del gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2B que conduce a una actividad del enzima SBEIIa reducida en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. 14. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la planta es Triticum aestivum ssp aestivum. 15. Grano según la reivindicación 14, que comprende una variación genética que conduce a una actividad de enzima ramificador del almidón reducida codificada por el gen SBEIIa en el(los) brazo(s) largo(s) del cromosoma 2B, del cromosoma 2D o ambos cromosomas, respecto al grano de tipo salvaje, en el que dicha variación genética comprende una ausencia de gen SBEIIa de por lo menos uno de dichos cromosomas o una mutación del gen SBEIIa de por lo menos uno de dichos cromosomas que conduce a una actividad reducida del enzima SBEIIa en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. 16. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en el que el nivel de actividad del enzima SBEIIa es reducido en por lo menos 40% respecto al grano de tipo salvaje. 58   17. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la amilopectina del grano presenta una proporción reducida de la fracción de longitud de cadena de 4 a 12 dp respecto a la amilopectina del grano de tipo salvaje, medida tras la desramificación con isoamilasa de la amilopectina. 18. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que es no arrugado. 19. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que presenta un peso medio de por lo menos 36 mg. 20. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que por lo menos 50% de los gránulos de almidón del grano presentan una apariencia no birrefringente al observarlas bajo luz polarizada. 21. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el contenido de almidón del grano en el caso de que esté desnudo es de por lo menos 25% (p/p) o que presenta un contenido de almidón que es por lo menos 90% del contenido de almidón del grano de tipo salvaje. 22. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 que es un grano integral o molido, pulverizado, perlado, laminado, triturado o precocido. 23. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprende además un nivel reducido de la proteína SBEI, de actividad del enzima SBEI o de ambos. 24. Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende además un nivel alterado de un enzima en comparación con el grano de tipo salvaje, en el que dicho enzima se selecciona de entre el grupo constituido por ADP glucosa pirofosforilasa, GBSS, SSI, SSII, SSIII, un enzima desramificador de tipo isoamilasa, un enzima desramificador de tipo pululanasa y cualquier combinación de los mismos. 25. Planta del trigo que puede producir el grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24. 26. Planta del trigo según la reivindicación 25 que es Triticum Aestivum ssp. aestivum o Triticum turgidum L. ssp. durum. 27. Gránulos de almidón extraídos del grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en los que la proporción de amilosa en el almidón de los gránulos es de por lo menos 50%. 28. Almidón extraído del grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la proporción de amilosa en dicho almidón de los gránulos es de por lo menos 50%. 29. Producto que comprende el grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o harina, harina integral, sémola o almidón producido(a) a partir del grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o cualquier combinación de los mismos. 30. Producto según la reivindicación 29, en el que la harina, harina integral, sémola o almidón se combina con harina, harina integral, sémola o almidón procedente de otra fuente. 31. Producto según la reivindicación 29 que es un producto no alimenticio. 32. Composición que comprende el almidón según la reivindicación 28 y otro ingrediente alimenticio o agua. 33. Procedimiento para producir una planta del trigo que puede producir grano que comprende las etapas siguientes: i) introducir una variación genética en una planta o semilla madre de trigo, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambos, con respecto al grano de tipo salvaje, que comprende la introducción de un ácido nucleico que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa en una célula regenerable de trigo y regenerar una planta de trigo transgénico a partir de la célula transformada, en el que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa, e ii) identificar una planta o semilla progenie de la planta o semilla madre de trigo, que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambas, con respecto al grano de tipo salvaje, en el que el grano comprende almidón y en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%. 34. Procedimiento de producción de almidón, que comprende: (i) obtener grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, e (ii) extraer el almidón de dicho grano. 59   35. Procedimiento de producción de una planta del trigo que puede producir grano, que comprende las etapas siguientes: i) introducir una variación genética en una planta o semilla madre de trigo, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de la expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambas, con respecto al grano de tipo salvaje, que comprende: o inducir artificialmente una mutación en la semilla o planta madre de trigo con un agente químico o radiación, o identificar una planta o semilla del trigo que presenta una mutación en un gen SBEIIa o un gen SBEIIb, que comprende las etapas que consisten en cribar una población de plantas o semillas del trigo con un marcador molecular que se encuentra ligado al gen SBEIIb, o al gen SBEIIa, respectivamente, del trigo; e identificar la planta o semilla basándose en la presencia o ausencia del marcador molecular ligado, e ii) identificar una planta o semilla progenie de la planta o semilla madre del trigo, que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambas, respecto al grano de tipo salvaje; en el que el grano comprende almidón y en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%. 36. Procedimiento de producción de una planta del trigo que puede producir grano que comprende las etapas siguientes: i) introducir una variación genética en una planta o semilla madre del trigo, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambas, con respecto al grano de tipo salvaje, que comprende: o inducir artificialmente una mutación en una semilla o planta madre del trigo con un agente químico o radiación, o identificar una planta o semilla del trigo que presenta una mutación en un gen SBEIIa, o un gen SBEIIb, que comprende las etapas que consisten en cribar una población de plantas o semillas del trigo con un anticuerpo que es específico para la proteína SBEIIb o la proteína SBEIIa, respectivamente, del trigo, e identificar la planta o semilla basándose en la presencia o ausencia de unión del anticuerpo, e ii) identificar una planta o semilla progenie de la planta o semilla madre del trigo, que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambas, con respecto al grano de tipo salvaje, en el que el grano comprende almidón y en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%.   61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79     81   82   83   84     86   87   88