Una célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería para la producción aumentada de productos bioquímicos derivados de oxaloacetato,

en la que dicha célula expresa una piruvato carboxilasa, en la que dicha célula antes de la manipulación mediante ingeniería carece de una piruvato carboxilasa endógena, con la condición de que dicha célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería no sea una célula de Escherichia coli

Sobreexpresión de piruvato carboxilasa para la producción aumentada de sustancias bioquímicas derivadas de oxaloacetato en células microbianas.

Antecedentes de la invención

Existe un tremendo potencial comercial para producir productos bioquímicos derivados de oxaloacetato vía procesos de fermentación bacteriana aerobia o anaerobia. Los procesos de fermentación aerobia se pueden usar para producir aminoácidos derivados de oxaloacetato, tales como asparagina, aspartato, metionina, treonina, isoleucina, y lisina. En particular, la lisina es de gran interés comercial en el comercio mundial. Las materias primas representan una porción significativa del coste de producción de lisina, y por tanto el rendimiento del proceso (producto generado por sustrato consumido) es una medida importante del comportamiento y viabilidad económica. La regulación metabólica restrictiva del flujo de carbono (descrito más abajo) puede limitar los rendimientos del proceso. El flujo de carbono hacia oxaloacetato (OAA) permanece constante independientemente de las perturbaciones del sistema (J. Vallino et al., Biotechnol. Bioeng., 41, 633-646 (1993)). En una fermentación dada a conocer, para mantener esta rígida regulación de flujo de carbono a las bajas velocidades de crecimiento deseables para la producción de lisina, las células convirtieron menos carbono en oxaloacetato, limitando de ese modo el rendimiento de la lisina (R. Kiss et al., Biotechnol. Bioeng., 39, 565-574 (1992)). Por tanto, existe una tremenda oportunidad para mejorar el proceso, evitando la regulación metabólica de flujo de carbono.

Los procesos de fermentación anaerobia se pueden usar para producir ácidos orgánicos derivados de oxaloacetato, tales como malato, fumarato y succinato. También se pueden usar procesos químicos que usan materia prima petrolífera, y han sido históricamente más eficaces para la producción de estos ácidos orgánicos que las fermentaciones bacterianas. El ácido succínico en particular, y sus derivados, tienen gran potencial para uso como productos químicos de especialidad. Se pueden emplear ventajosamente en diversas aplicaciones en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética, y también pueden servir como materiales de partida en la producción de productos químicos tales como 1,4-butanodiol y tetrahidrofurano (L. Schilling, FEMS Microbiol. Rev., 16, 101-110 (1995)). Las bacterias anaerobias de la panza de animales se han considerado para uso en la producción de ácido succínico vía procesos de fermentación bacteriana, pero estas bacterias tienden a sufrir una lisis durante la fermentación. Más recientemente, se ha usado Anaerobiospirillum succiniciproducens estrictamente anaerobia, que es más robusta y produce mayores niveles de succinato (R. Datta, patente U.S. 5.143.833 (1992); R. Datta et al., Eur. Sol. Pat. Eur. 405707 (1990)).

Los procesos de fermentación comerciales usan hidratos de carbono derivados de cosechas para producir productos bioquímicos en masa. La glucosa, un sustrato de hidrato de carbono común, se metaboliza habitualmente vía la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), también conocida como la ruta glucolítica, a fosfoenolpiruvato (PEP) y después a piruvato. Todos los organismos derivan alguna energía de la ruptura glucolítica de la glucosa, independientemente de si se hacen crecer aeróbica o anaeróbicamente. Sin embargo, más allá de estos dos intermedios, las rutas para el metabolismo del carbono son diferentes dependiendo de si el organismo crece aeróbica o anaeróbicamente, y los destinos de PEP y piruvato dependen del organismo particular implicado, así como de las condiciones bajo las cuales está teniendo lugar el metabolismo.

En el metabolismo aerobio, los átomos de carbono de la glucosa se oxidan completamente a dióxido de carbono en un proceso cíclico conocido como el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) o, algunas veces, el ciclo del ácido cítrico, o ciclo de Krebs. El ciclo del TCA comienza cuando el oxaloacetato se combina con acetil-CoA para formar citrato. La oxidación completa de glucosa durante el ciclo del TCA libera en último lugar significativamente más energía a partir de una sola molécula de glucosa que la que se extrae durante la glucolisis sola. Además de alimentar el ciclo del TCA en fermentaciones aerobias, el oxaloacetato también sirve como un precursor importante para la síntesis de los aminoácidos asparagina, aspartato, metionina, treonina, isoleucina y lisina. Esta ruta aerobia se muestra en la Fig. 1 para Escherichia coli, el microorganismo más comúnmente estudiado. Los organismos anaerobios, por otra parte, no oxidan completamente la glucosa. En su lugar, se usan el piruvato y el oxaloacetato como moléculas aceptoras en la reoxidación de cofactores reducidos (NADH) generados en la ruta de EMP. Esto conduce a la generación y acumulación de productos bioquímicos reducidos tales como acetato, lactato, etanol, formiato y succinato. En la Fig. 2 se muestra esta ruta anaerobia para E. coli.

Los intermedios del ciclo del TCA también se usan en la biosíntesis de muchos compuestos celulares importantes. Por ejemplo, el α-cetoglutarato se usa para biosintetizar los aminoácidos glutamato, glutamina, arginina, y prolina, y la succinil-CoA se usa para biosintetizar porfirinas. En condiciones anaerobias, estos intermedios importantes todavía son necesarios. Como resultado, la succinil-CoA, por ejemplo, se obtiene en condiciones anaerobias a partir de oxaloacetato en una reacción inversa; es decir, el ciclo del TCA se lleva a cabo hacia atrás desde el oxaloacetato hasta la succinil-CoA.

El oxaloacetato que se usa para la biosíntesis de estos compuestos se debe de reponer si el ciclo del TCA va a continuar sin decaimiento y se va a mantener la funcionalidad metabólica. Muchos organismos han desarrollado así lo que se conoce como "rutas anapleróticas", que regeneran intermedios para el reclutamiento en el ciclo del TCA. Entre las reacciones importantes que logran este reabastecimiento están aquellas en las que se forma oxaloacetato a partir de PEP o piruvato. Estas rutas que resuministran intermedios al ciclo del TCA se pueden utilizar durante el metabolismo aerobio o anaerobio.

PEP ocupa una posición central, o nodo, en el metabolismo de hidratos de carbono. Como el intermedio final en la glucolisis, y por tanto el precursor inmediato en la formación de piruvato vía la acción de la enzima piruvato cinasa, puede servir como una fuente de energía. Adicionalmente, PEP puede reponer intermedios en el ciclo del TCA vía la acción anaplerótica de la enzima PEP carboxilasa, que convierte PEP directamente en el intermedio de TCA oxaloacetato. A menudo, PEP es también un cosustrato para la captación de glucosa en la célula vía el sistema de fosfotransferasa (PTS), y se usa para biosintetizar aminoácidos aromáticos. En muchos organismos, los intermedios del ciclo del TCA se pueden regenerar directamente a partir de piruvato. Por ejemplo, la piruvato carboxilasa (PYC), que se encuentra en algunas bacterias pero no en E. coli, media la formación de oxaloacetato mediante la carboxilación de piruvato utilizando carboxibiotina. Como se puede esperar, el reparto de PEP está regulado rígidamente por mecanismos de control celulares, provocando un "cuello de botella" metabólico que limita la cantidad y dirección de carbono que fluye a través de esta coyuntura. En la Fig. 3 se muestran las conversiones, mediadas por enzimas, que se producen entre PEP, piruvato y oxaloacetato.

Los intermedios del ciclo del TCA también se pueden regenerar en algunas plantas y microorganismos a partir de acetil-CoA vía lo que se conoce como la "derivación del glioxilato", "bypass de glioxilato" o ciclo de glioxilato (Fig. 4). Esta ruta permite crecer a los organismos sobre sustratos de 2 carbonos, para reponer su oxaloacetato. Los ejemplos de sustratos de 2 carbonos incluyen acetato y otros ácidos grasos, así como n-alcanos de cadena larga. Estos sustratos no proporcionan ningún intermedio de 3 carbonos tal como PEP, que se puede carboxilar para formar oxaloacetato. En la derivación del glioxilato, el isocitrato procedente del ciclo del TCA se escinde en glioxilato y succinato mediante la enzima isocitrato liasa. El glioxilato liberado se combina con acetil-CoA para formar malato mediante la acción de la enzima malato sintetasa. Tanto succinato como malato generan oxaloacetato mediante el ciclo del TCA. La expresión de los genes que codifican las enzimas del bypass del glioxilato está fuertemente controlada, y normalmente estos genes son reprimidos cuando están disponibles compuestos de 3 carbonos.... [Seguir leyendo]

1. Una célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería para la producción aumentada de productos bioquímicos derivados de oxaloacetato, en la que dicha célula expresa una piruvato carboxilasa, en la que dicha célula antes de la manipulación mediante ingeniería carece de una piruvato carboxilasa endógena, con la condición de que dicha célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería no sea una célula de Escherichia coli.

2. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de la reivindicación 1, que es una célula bacteriana.

3. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de cualquier reivindicación anterior, que es un auxótrofo para la alanina, un auxótrofo para la valina, un mutante para el acetato, o cualquier combinación de los mismos.

4. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de cualquier reivindicación anterior, que expresa una piruvato carboxilasa derivada de Rhizobium etli.

5. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de la reivindicación 4, que se ha transformado con un gen pyc de R. etli.

6. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de cualquier reivindicación anterior, que expresa una piruvato carboxilasa derivada de Pseudomonas fluorescens.

7. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de la reivindicación 6, que se ha transformado con un gen pyc de P. fluorescens.

8. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de cualquier reivindicación anterior, que comprende además PEP carboxilasa, en la que la célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería sobreexpresa PEP carboxilasa.

9. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de la reivindicación 8, que expresa PEP carboxilasa derivada de Anacystis nidulans.

10. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de cualquier reivindicación anterior, que comprende además PEP carboxilasa, en la que la célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería expresa PEP carboxicinasa a un nivel menor que el nivel de PEP carboxicinasa expresado en la célula de tipo natural correspondiente.

11. La célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería de la reivindicación 10, que no expresa un nivel detectable de PEP carboxicinasa.

12. Un método para obtener una célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería para la producción aumentada de productos bioquímicos derivados de oxaloacetato, en el que dicha célula expresa una piruvato carboxilasa, comprendiendo el método transformar una célula con un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que tiene actividad de piruvato carboxilasa para producir una célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería que expresa una piruvato carboxilasa, en el que dicha célula antes de la transformación carece de una piruvato carboxilasa endógena, con la condición de que dicha célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería no sea una célula de Escherichia coli.

13. El método de la reivindicación 12, que comprende además transformar la célula con un fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica PEP carboxilasa, tal como la célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería que sobreexpresa PEP carboxilasa.

14. El método de la reivindicación 12, en el que la célula manipulada metabólicamente mediante ingeniería no expresa un nivel detectable de PEP carboxicinasa.

15. Un método para obtener un producto bioquímico derivado de oxaloacetato, que comprende: