REACTIVO DE ENSAYO CROMÓGENO, ESTABLE, Y SU EMPLEO EN ENSAYOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA COAGULACIÓN.

Preparacion liquida, que contiene a) un substrato peptidico cromogeno y b) un inhibidor de la polimerizacion de la fibrina,

que esta constituido por un oligopeptido, que inhibe la polimerizacion de los monomeros de fibrina, que se forman bajo la accion de la trombina, caracterizada porque el valor del pH de la preparacion se encuentra situado en el intervalo comprendido entre 3,0 y 6,0

La presente invención se refiere a un reactivo de ensayo cromógeno, que es adecuado de manera especial para ser empleado en ensayos de diagnóstico de la coagulación y que se caracteriza porque en estado líquido presenta una elevada estabilidad y, respectivamente, una elevada capacidad de conservación.

Un gran número de ensayos para diagnóstico está basado en el empleo de substratos cromógenos. Para llevar a cabo la determinación de factores con actividad de proteasa, tal como por ejemplo por la determinación de los factores de la coagulación en muestras de sangre o en muestras de plasma, son empleados de manera usual substratos peptídicos cromógenos, que están constituidos por una porción especifica de oligopéptidos y respectivamente de polipéptidos y por una porción de cromóforos – (portadores de color). El substrato peptídico cromógeno, que es inicialmente incoloro, se disocia en función de la cantidad y respectivamente de la actividad del factor proteolítico, que está contenido en la muestra, con lo cual es liberado el cromóforo, que puede ser medido entonces por vía fotométrica. En los documentos de patente EP 34 122 A1 y US 4,508,644 se ha descrito una pluralidad de substratos peptídicos cromógenos y su empleo en ensayos para diagnóstico, por ejemplo para llevar a cabo la determinación de los factores de la coagulación factor IIa (trombina) y factor Xa. En el documento EP 78 764 A1 se ha descrito un procedimiento cromógeno para llevar a cabo la determinación del factor de la coagulación XIIa. En el documento EP 420 332 A2 se ha descrito un procedimiento cromógeno para llevar a cabo la determinación del factor de la coagulación IIa (trombina).

En el documento EP 0 408 075 A2 se describe un procedimiento para llevar a cabo la determinación de la antitrombina III en líquidos corporales. El reactivo de ensayo correspondiente contiene un substrato peptídico cromógeno y un tetrapéptido (Gly-Pro-Arg-Pro) como inhibidor de la polimerización de la fibrina.

Los cromóferos, que son empleados de una manera especialmente frecuente son, por ejemplo, la para-nitroanilina (pNA) o el ácido 5-amino-2-nitro-benzoico (ANBA), cuyo color amarillo puede ser medido con una longitud de onda de λ = 405 nm.

En el diagnóstico de la coagulación se lleva a cabo la determinación de la actividad de los factores enzimáticamente activos en muestras de sangre o en muestras de plasma, de manera usual, bajo condiciones tan parecidas como sea posible a las condiciones fisiológicas. Es especialmente importante que se garantice un valor del pH fisiológico de aproximadamente 7,4 en la preparación para el ensayo. Con objeto de impedir modificaciones del valor del pH en la preparación para el ensayo, están disueltas las substancias de ensayo, que tiene que ser mezcladas con la muestra de sangre y respectivamente con la muestra de plasma, de manera usual en tampones con un valor del pH neutro hasta ligeramente básico.

Desde luego, el inconveniente de un diseño del ensayo de este tipo consiste en que algunos componentes del ensayo presentan una estabilidad aminorada en medio neutro hasta básico. De este modo, por ejemplo la pNA presenta a un valor del pH de > 6,0 una descomposición acelerada. La coloración amarilla resultante de la solución del substrato de pNA imposibilita un empleo ulterior de la solución y, respectivamente, una evaluación fiable del ensayo. Por este motivo los substratos de pNA son liofilizados usualmente para llevar a cabo su almacenamiento a largo plazo y solamente son disueltos en un líquido neutro cuando sea necesario. Con objeto de impedir la descomposición de los substratos de pNA en soluciones, es conocido el hecho de ajustar en el intervalo ácido el valor del pH de la solución del substrato.

Para diversos ensayos de la coagulación cromógenos es necesario llevar a cabo la activación de la cascada de la coagulación con formación de trombina o es necesario aportar directamente trombina a la preparación para el ensayo pero, sin embargo, hay que impedir al mismo tiempo la formación de un coagulo de fibrina con objeto de prevenir turbideces que perjudicarían la medición fotométrica de la muestra. Esto puede llevarse a cabo, por ejemplo, por medio del empleo de inhibidores de la polimerización de la fibrina en la preparación para el ensayo. Estos inhibidores, denominados Clot, están constituidos con frecuencia por oligopéptidos, que inhiben la asociación mutua (polimerización) de los monómeros de fibrina, que se forman bajo la acción de la trombina y, de ese modo, impiden la formación de coágulos (véase por ejemplo la publicación EP 0 456 152 B1).

Los criterios que deben tenerse en consideración a la hora de llevar a cabo el desarrollo de reactivos, que proporcionen los componentes, que son necesarios para un procedimiento de ensayo son, entre otros, una manipulación sencilla y una capacidad de conservación tan prolongada como sea posible. Son especialmente preferentes las formulaciones liquidas de reactivos, que sean estables a largo plazo puesto que, con ocasión de la reconstitución de los componentes liofilizados por parte del usuario, pueden producirse errores, que pueden tener un efecto negativo sobre la calidad del procedimiento de ensayo en su conjunto.

La presente invención tenía como tarea proporcionar un reactivo estable a largo plazo, especialmente en estado

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líquido, que contuviese, tanto un substrato peptídico cromógeno así como, también, un inhibidor Clot y que, por lo tanto, fuese especialmente adecuado para ser empleado en ensayos cromógenos de la coagulación, que son evaluados por vía fotométrica.

La solución de la tarea consiste en la puesta a disposición del procedimiento y de los objetos de conformidad con la invención, que están descritos en las reivindicaciones.

De manera esencial, la presente invención se refiere a una preparación líquida, que contiene un substrato peptídico cromógeno y a un inhibidor de la polimerización de la fibrina, que está constituido por un oligopéptido, que inhibe la polimerización de los monómeros de fibrina, que se forman bajo la acción de la trombina y que, además, se caracteriza porque el valor del pH de la preparación se encuentra situado en el intervalo comprendido entre 3,0 y 6,0, de manera preferente se encuentra situado en el intervalo comprendido entre 4,0 y 5,0. En una forma de realización especialmente preferente, el valor del pH del reactivo es de 4,6 ± 0,1.

Para llevar a cabo el ajuste del valor de pH se aportan donadores de protones a la preparación líquida, acuosa, es decir que son aportados ácidos y, respectivamente, sus sales. Pueden ser empleados ácidos y, respectivamente, donadores de protones orgánicos o inorgánicos. Un sistema tampón adecuado puede ser necesario con objeto de garantizar un valor estable del pH y para impedir, por ejemplo, la alcalinización por parte del dióxido de carbono.

Una forma de realización especialmente preferente de una preparación, de conformidad con la invención, contiene iones acetato (CH3COO -). Otro objeto de la presente invención consiste, por lo tanto, en un procedimiento para llevar a cabo la obtención de un reactivo de ensayo, según el cual se combinan un substrato peptídico cromógeno y un inhibidor de la polimerización de la fibrina, que está constituido por un oligopéptido, que inhibe la polimerización de los monómeros de fibrina, que se forman bajo la acción de la trombina, y se ajusta el valor del pH del reactivo con ácido acético hasta un valor situado en el intervalo comprendido entre 3,0 y 6,0, de manera preferente se ajusta hasta un valor situado en el intervalo comprendido entre 4,0 y 5,0, de menara especialmente preferente se ajusta a un valor de 4,6 ± 0,1.

De manera sorprendente, una preparación de conformidad con la invención en estado líquido dispone de una elevada estabilidad y, por lo tanto, de una capacidad de almacenamiento más prolongada que la de una preparación correspondiente, con un valor de pH neutro en estado líquido o liofilizado.

Se ha podido observar que una preparación, de conformidad con la invención, en estado líquido presenta durante un periodo de tiempo de 60 semanas, a una temperatura de almacenamiento de 4ºC, una desviación del valor de medición con respecto al valor inicial no mayor que un 10 %. Como valor inicial debe entenderse el valor de medición o el resultado del ensayo, que ha sido determinado por medio del empleo de la preparación como reactivo de ensayo el día de la obtención... [Seguir leyendo]

1. Preparación líquida, que contiene

a) un substrato peptídico cromógeno y

b) un inhibidor de la polimerización de la fibrina, que está constituido por un oligopéptido, que inhibe la polimerización de los monómeros de fibrina, que se forman bajo la acción de la trombina,

caracterizada porque el valor del pH de la preparación se encuentra situado en el intervalo comprendido entre 3,0 y 6,0.

2. Preparación según la reivindicación 1, caracterizada porque están contenidos iones acetato.

3. Preparación según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque está contenido un substrato peptídico acoplado con la para-nitroanilina a título de substrato peptídico cromógeno.

4. Preparación según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque está contenido un substrato peptídico acoplado con el ácido 5-amino-2-nitro-benzoico a título de substrato peptídico cromógeno.

5. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque está contenido un substrato peptídico cromógeno, que es disociado por la trombina.

6. Preparación según la reivindicación 5, caracterizada porque está contenido un substrato peptídico cromógeno con la secuencia Ala-Gly-Arg-R1, significando R1 un grupo cromógeno.

7. Preparación según la reivindicación 5, caracterizada porque está contenido un substrato peptídico cromógeno con la secuencia Msc-Val-Arg-R1, significando Msc metilsulfoniletiloxicarbonilo y significando R1 un grupo cromógeno.

8. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque está contenido un inhibidor de la polimerización de la fibrina con la secuencia peptídica general GPRP-X-NH2, significando G el aminoácido constituido por la glicina, P el aminoácido constituido por la L-prolina, R el aminoácido constituido por la L-arginina y X significa alanina o glicina.

9. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque están contenidos adicionalmente uno o varios estabilizantes.

10. Procedimiento para la obtención de una preparación según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el valor del pH de la preparación se ajusta a un valor situado en el intervalo comprendido entre 3,0 y 6,0 por medio de la adición de un donador de protones.

11. Procedimiento según al reivindicación 10, caracterizado porque el valor del pH de la preparación se ajusta a un valor situado en el intervalo comprendido entre 3,0 y 6,0 por medio de la adición de ácido acético.

12. Empleo de la preparación según una de las reivindicaciones 1 a 9 como reactivo de ensayo en un procedimiento de ensayo para llevar a cabo la determinación de un parámetro de la coagulación en una muestra de sangre integral

o en una muestra de plasma.

13. Empleo de una preparación según una de las reivindicaciones 1 a 9 como reactivo de ensayo en un procedimiento para llevar a cabo la determinación de la generación de trombina en una muestra de sangre integral o en una muestra de plasma.

14. Empleo de una preparación según una de las reivindicaciones 1 a 9 como reactivo de ensayo en un procedimiento de ensayo para llevar acabo la determinación del potencial endógeno de la trombina de una muestra de sangre integral o de una muestra de plasma.

15. Estuche de ensayo para llevar a cabo la realización de un procedimiento de ensayo cromógeno, caracterizado porque contiene una preparación según la reivindicación 1.