PROTECCIÓN CONTRA LA TOXICIDAD AMBIENTAL A TRAVÉS DE LA MANIPULACIÓN DEL PROCESAMIENTO DE PRECURSORES DE ARN MENSAJERO.

Un método para mejorar la tolerancia al estrés en células y organismos que comprende la manipulación genética y/o bioquímica en dichas células y organismos de:

(A) al menos un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos 50% idéntica al polipéptido representado en la SEQ ID NO: 3 y/o un fragmento funcional del mismo en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por: (i) contener un dominio RS; y (ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos o partes de dicha planta; o (B) un ácido nucleico que codifica al polipéptido o fragmento funcional del mismo como se define en (A)

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de ácidos nucleicos y de proteínas involucrados en el procesamiento de precursores de ARN mensajero para mejorar la tolerancia al estrés ambiental tal como la toxicidad por sales minerales en células y organismos eucariotas.

Antecedentes de la invención

La naturaleza de los objetivos celulares sensibles a la toxicidad por sodio y litio representa un importante vacío en nuestro conocimiento sobre la fisiología de la homeostasis iónica en células eucariotas. La caracterización de estos objetivos es esencial para la comprensión de problemas clínicos tales como los efectos del litio sobre la terapia para el trastorno dipolar [Schou (1997) Arch, Gen. Psychiatry 54, 9] o altos niveles de sodio asociados con hipertensión [Lifton (1996) Science 272, 676). Otro problema, completamente diferente pero también relacionado con homeostasis iónica, es la salinización progresiva de tierras cultivadas sometidas a intensa irrigación, que ha convertido al fitomejoramiento de las plantas de cultivo para tolerancia a la salinidad en una urgente necesidad para el desarrollo de una agricultura sostenible en las regiones [Serrano (1996) Int. Rev. Cytol. 165; 1; Yeo (1998) J. Exp. Bot. 49, 915; Holmberg & Bülow (1998) Trends Plant Sci. 3, 61].

Aparte del transporte de iones [Haro et al. (1991) FEBS Lett. 291, 189; Gaxiola et al. (1999) Proc. natl. Acad. Sci. USA 96, 1480; Apse et al. (1999) Science 285, 1256] y de la síntesis de osmolitos [Tarczynski et al. (1993) Science 259, 508; Kishor et al. (1995) Plant Physiol. 108, 1387: Alia et al. (1998) Plant J. 16, 155], la manipulación de sistemas celulares más sensibles a altas concentraciones de iones y a estrés por agua ofrece rutas alternativas para mejorar la tolerancia a la sal por parte de las plantas de cultivo [Serrano (1996) Int. Rev. Cytol. 165, 1; Tezara et al. (1999) Nature 401, 914].

Los análisis genéticos y bioquímicos han permitido identificar el producto del gen HAL2 de lavadura como un importante objetivo fisiológico de la toxicidad por sal [Gläser et al. (1993) EMBO J. 12, 3105; Dichtl et al. (1997) EMBO J. 16, 7184]. HAL2 codifica una 3',5'-bifosfato nucleotidasa, que es muy sensible a la inhibición por litio y sodio [Murguia et al. (1995) Science 267, 232]. La inhibición de sal de Hal2p resulta en una acumulación intracelular de 3'-fosfoadenosina 5'-fosfato (pAp) [Murguia et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 29029], un compuesto tóxico que a su vez inhibe las reacciones de reducción y transferencia de grupos sulfato, así como algunas exorribonucleasas [Dichtl et al. (1997) EMBO J. 16, 7184; Gil-Mascarell et al. (1999) Plant J. 17, 373]. Existen genes homólogos a HAL2 en plantas [Gil-Mascarell et al. (1999) Plant J. 17, 373] y en mamíferos [López-Coronado et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 16043] aunque en el último caso la enzima codificada es inhibida por el litio pero no por el sodio.

La tolerancia a la sal conferida por la sobreexpresión de Hal2p, la proteína de tipo silvestre así como versiones mutadas resistentes al litio y al sodio, es relativamente modesta [Albert et al. (2000) J. Mol. Biol. 295, 927]. Esto sugiere la existencia de objetivos adicionales de toxicidad por sal, que se convierte en limitante una vez que se supera el cuello de botella de HAL2, pero aún no se conoce la naturaleza de estos importantes procesos sensibles a la sal.

Dos solicitudes de patente que se relacionan con estrés osmótico pero que describen mecanismos de protección diferentes al mecanismo general descrito en la presente invención son las siguientes: ES2110918A (1998-02-16) que se relaciona con la producción de plantas tolerantes a estrés osmótico a través de la manipulación del metabolismo de carbohidratos y ES2134155A1 (1998-10-07) que se relaciona con un método para conferir tolerancia a estrés osmótico, por agua y sal en plantas glicofílicas, a través del uso de genes que codifican proteínas con actividad de peroxidasa.

Resumen de la invención El problema técnico fundamental de la presente invención es el de proporcionar un método que pueda ser utilizado para mejorar la tolerancia al estrés de células y de organismos que sufran de condiciones de estrés tales como estrés osmótico, causado por salinidad, sequía o estrés por frío y congelación.

Una solución a este problema técnico se logra suministrando una protección contra estrés osmótico en células y en organismos a través de la manipulación del procesamiento del ARN mensajero. La presente invención proporciona un conjunto de genes aislados que son capaces de conferirle a una célula huésped heteróloga u organismo huésped tolerancia a las condiciones de estrés. Estos genes están todos involucrados en el procesamiento de precursores de ARNm (tal como síntesis, empalme, modificación del extremo 5' y 3', movimiento, transporte hasta el citoplasma, metabolismo, etc.) y todos mostraron un fenotipo de resistencia a la salinidad cuando transformaron separadamente a un mutante de levadura sensible a la sal. Haciendo esto, cada gen actúa como un eficiente reforzador de la tolerancia al estrés, sin la ayuda de factores adicionales.

Este grupo de genes, que incluye proteínas del tipo SR, factores de enlazamiento de ARN (nuclear), componentes de complejos de ribonucleoproteína, factores de transcripción, y proteínas de movimiento nuclear, permiten que la persona capacitada en el arte altere genéticamente al organismo de interés con el propósito de hacerlo tolerante a situaciones de estrés tales como situaciones de estrés osmótico, más particularmente toxicidad por Na+ o Li+ o por una sal mineral. Cada uno de los genes divulgados le permite a la persona capacitada en el arte modificar el destino de la célula y/o el desarrollo de la planta y/o la bioquímica y/o la fisiología por medio de la introducción de al menos uno de estos genes dentro de la célula. Para el cultivo de plantas de cultivo por ejemplo, muchas de la cuales son sensibles a condiciones de estrés como salinidad, sequía o frío, los genes divulgados ofrecen la posibilidad de resolver el problema de un menor rendimiento y menor beneficio económico.

Esta invención ofrece una solución para la toxicidad celular provocada por estrés ambiental a través de la manipulación del procesamiento de precursores de ARN mensajero y las modalidades de la invención incluyen métodos, ácidos nucleicos, polipéptidos, vectores, células huésped y organismos transgénicos tales como plantas transgénicas.

Descripción detallada de la invención

La salinidad del suelo es uno de los estreses abióticos o ambientales más significativos para la agricultura de plantas. Aparte del éxito práctico del mejoramiento genético de la tolerancia a la sal de las plantas de cultivo, la investigación de tolerancia a la sal representa una parte importante de la biología básica de la planta. También la investigación sobre otros dos estreses abióticos principales, sequía y frío, está íntimamente relacionada con el trabajo sobre estrés por salinidad. Por ejemplo, muchos genes que están regulados por el estrés por salinidad son también responsables por el estrés por sequía o por frío (Zhu J. K., 1997, Molecular aspects of osmotic stress in plants, CRC Crit. Rev. Plant Sci. 16 253 - 277). Una persona capacitada en el arte puede asumir por lo tanto que cuando un gen aislado confiere tolerancia a la sal a un organismo huésped cuando se lo transfecta aquí, podría conferir también tolerancia al estrés por sequía y/o frío. La salinidad, la sequía y el frío se considera que son las tres formas más importantes de estrés osmótico.

Con el propósito de identificar nuevos objetivos de toxicidad ambiental en células eucariotas, los inventores caracterizaron genes que confieren un incremento en la tolerancia a sales minerales cuando se expresan en células de levadura. Por lo tanto, se buscaron bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana [Minet et al. (1992) Plant J. 2, 417] y Beta vulgaris que pudieran conferir tolerancia al estrés por salinidad por medio de sobreexpresión en células de levadura, en las cuales la acumulación de pAp, y su efecto tóxico, fueron evitados por medio de la adición de metionina al medio de cultivo [Gläser et al. (1993) EMBO J. 12, 3105; Dichtl et al. (1997) EMB J. 16, 7184; Murguía et al. (1995) Science 267, 232; Murguía et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 29029]. Los resultados de esta estrategia han dado lugar a la presente invención. Esta es una aproximación funcional para la identificación de genes y proteínas que están... [Seguir leyendo]

1. Un método para mejorar la tolerancia al estrés en células y organismos que comprende la manipulación genética y/o bioquímica en dichas células y organismos de:

(A) al menos un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que es al menos 50% idéntica al polipéptido representado en la SEQ ID NO: 3 y/o un fragmento funcional del mismo en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por:

(i) contener un dominio RS; y

(ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos o partes de dicha planta; o

(B) un ácido nucleico que codifica al polipéptido o fragmento funcional del mismo como se define en (A).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la manipulación genética y/o bioquímica en las células y organismos de:

(A) al menos un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 3 y/o un fragmento funcional de la misma en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por:

(i) contener un dominio RS; y

(ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos o partes de dicha planta; o

(B) un ácido nucleico que codifica al polipéptido o fragmento funcional del mismo como se define en (A).

3. El método de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el ácido nucleico como se define en la reivindicación 1(B) o en la reivindicación 2(B) se escoge del grupo que consiste de:

(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN como la dada en la SEQ ID NO 1 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 1 o el complemento de la misma,

(c) un ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético hasta una secuencia de nucleótidos com la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b),

(d) un ácido nucleico que diverge debido a las diferencias en el uso del codón entre los organismos hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b),

(e) un ácido nucleico que diverge debido a las diferencias en alelos hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b),

(f) un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de la proteína codificada por la secuencia de ADN como la dada en la SEQ ID NO 1, en donde dicho fragmento funcional es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, ó 3(a) y (c) hasta (f), caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho ácido nucleico se deriva de una célula eucariota.

6. El método para mejorar o alterar la tolerancia al estrés en una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende la expresión en células, tejidos o partes de dicha planta de al menos un ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; o de al menos un polipéptido y/o fragmento

funcional del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; o al menos una molécula antisentido que contiene una secuencia complementaria a la de dicho ácido nucleico.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho estrés es estrés osmótico, estrés por salinidad, estrés por sequía, estrés por congelación o estrés por frío.

8. Un método para la producción de plantas transgénicas, células vegetales o tejidos vegetales que tienen tolerancia mejorada al estrés, que comprende la introducción de un ácido nucleico en un formato expresable, o un vector que contiene dicho ácido nucleico, dentro de dicha planta, célula vegetal o tejido vegetal, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácido que es al menos 50% idéntica a la del polipéptido representado en la SEQ ID NO: 3 o fragmento funcional del mismo, en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por:

(i) contener un dominio RS; y

(ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos

o partes de dicha planta.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende la introducción de un ácido nucleico en un formato expresable, o un vector que contiene dicho ácido nucleico, dentro de dicha planta, célula vegetal o tejido vegetal, en donde dicho ácido nucleico codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID NO: 3 o fragmento funcional de la misma, en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por:

(i) contener un dominio RS; y

(ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos

o partes de dicha planta.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en donde el ácido nucleico se escoge del grupo que consiste de:

(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN como la dada en la SEQ ID NO 1 o el complemento de la misma,

(b) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 1 o el complemento de la misma,

(c) un ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético hasta una secuencia de nucleótidos com la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b),

(d) un ácido nucleico que diverge debido a las diferencias en el uso del codón entre los organismos hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b),

(e) un ácido nucleico que diverge debido a las diferencias en alelos hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b),

(f) un ácido nucleico que codifica un fragmento funcional de la proteína codificada por la secuencia de ADN como la dada en la SEQ ID NO 1, en donde dicho fragmento funcional es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, ó 10(a) y (c) hasta (f), caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde dicho ácido nucleico se deriva de una célula eucariota.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde el ácido nucleico o un vector que contiene dicho ácido nucleico es introducido en forma estable en el genoma de la célula vegetal.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, que comprende además la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal.

15. Un método para la producción de plantas alteradas, células vegetales o tejidos vegetales con tolerancia mejorada al estrés, que comprende la introducción de un polipéptido con una secuencia de aminoácido que es al menos 50% idéntica a la del polipéptido representado en la SEQ ID NO: 3 y/o fragmento funcional del mismo directamente dentro de una célula, un tejido o un órgano de dicha planta, en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por:

(i) contener un dominio RS; y

(ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos

o partes de dicha planta.

16. El método de la reivindicación 15 que comprende la introducción de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos como la representada en la SEQ ID NO 3 y/o fragmento funcional de la misma directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta, en donde dicho fragmento funcional se caracteriza por:

(i) contener un dominio RS; y

(ii) mejorar la tolerancia al estrés en una planta transgénica cuando se expresa transgénicamente en células, tejidos

o partes de dicha planta.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en donde dicho estrés es estrés osmótico, estrés por salinidad, estrés por sequía, estrés por congelación o estrés por frío.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16 para incrementar el rendimiento.

19. El uso del ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, un vector que contiene dicho ácido nucleico, o el polipéptido y/o fragmento funcional del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 para incrementar el rendimiento.

20. El uso del ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, un vector que contiene dicho ácido nucleico, o el polipéptido y/o fragmento funcional del mismo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 para estimular el crecimiento de la planta, caracterizado porque dicho crecimiento de la planta puede ser en cualquier parte de esa planta, tal como raíz, hoja, semilla.

21. El uso de una planta que puede ser obtenida por cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 8 a 16 para cultivar sobre un suelo con un contenido de sal de más de 1 mM de iones de sal.

22. Un polipéptido de la secuencia de aminoácidos como la representada en la SEQ ID NO: 3.

23. Un ácido nucleico que codifica al polipéptido como se define en la reivindicación 22.

24. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 23 escogido del grupo que consiste de:

a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN como la dada en la SEQ ID NO 1 o el complemento de la misma, b) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ARN correspondiente a la SEQ ID NO 1 o el complemento de la misma, c) un ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b), d) un ácido nucleico que diverge debido a las diferencias en el uso del codón entre los organismos hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b), e) un ácido nucleico que diverge debido a las diferencias en alelos hasta una secuencia de nucleótidos como la dada en la SEQ ID NO 1 o como se define en (a) o (b).

25. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23, 24(a) y (c) hasta (e), caracterizado porque dicho ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

26. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en donde dicho ácido nucleico se deriva de una célula eucariota.

27. Un vector que contiene al ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26.

28. El vector de acuerdo a la reivindicación 27, en donde dicho ácido nucleico está operativamente enlazado a una o más secuencias de control permitiendo la expresión de dicho ácido nucleico en células huésped procariotas y/o eucariotas.

29. El vector de acuerdo a la reivindicación 28, en donde dicha secuencia de control es un promotor constitutivo.

30. Un método para la producción de plantas transgénicas, células vegetales o tejidos vegetales, que comprende la introducción del ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 en un formato expresable, o un vector que contiene dicho ácido nucleico, dentro de dicha planta, célula vegetal o tejido vegetal.

31. Un método para la producción de plantas alteradas, células vegetales o tejidos vegetales, que comprende la introducción del polipéptido como se define en la reivindicación 22 directamente en una célula, un tejido o un órgano de dicha planta.

32. Un método para efectuar la expresión del polipéptido como se define en la reivindicación 22, que comprende la introducción de un ácido nucleico que codifica a dicho polipéptido operativamente enlazado a una o más secuencias de control o un vector que contiene dicho ácido nucleico en forma estable dentro del genoma de una célula vegetal.

33. El método de la reivindicación 30 ó 32, que comprende además la regeneración de una planta a partir de dicha célula vegetal.

34. Una célula de una planta transgénica que puede ser obtenida por medio del método de la reivindicación 30, toda célula vegetal conteniendo un transgén como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 - 26.

35. Una planta transgénica tolerante al estrés por salinidad que expresa en forma transgénica al menos un ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, o una molécula antisentido que contiene una secuencia complementaria a la de dicho ácido nucleico, o al menos un polipéptido como se define en la reivindicación 22.

36. Una planta transgénica que expresa transgénicamente al menos un ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, o una molécula antisentido que contienen una secuencia complementaria a la de dicho ácido nucleico, o al menos un polipéptido expresado transgénicamente como se define en la reivindicación 22, en donde la planta muestra una alteración de su fenotipo.

37. Una parte cosechable de una planta de la reivindicación 35 ó 36, en donde dicha parte contiene al menos un ácido nucleico expresado transgénicamente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, o una molécula antisentido que contiene una secuencia complementaria a dicho ácido nucleico, o al menos un polipéptido expresado transgénicamente como se define en la reivindicación 22.

38. Una parte cosechable de acuerdo a la reivindicación 37 que se selecciona del grupo que consiste de semillas, hojas, frutos, cultivos de tallo, rizomas, raíces, tubérculos y bulbos.

39. La progenie transgénica derivada de cualquiera de las plantas o partes de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 35 a 38, en donde dicha progenie contiene al menos un ácido nucleico expresado transgénicamente como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, o una molécula antisentido que contiene una

secuencia complementaria a dicho ácido nucleico, o al menos un polipéptido expresado transgénicamente como se define en la reivindicación 22.

40. Nuevas cepas de levadura u otras eucariotas unicelulares más tolerantes al estrés por salinidad que expresan cualquiera de los ácidos nucleicos definidos en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 y/o del polipéptido como se define en la reivindicación 22.

41. Un sistema de cultivo de células in vitro que comprende células huésped animales o de planta tolerantes al estrés por salinidad obtenido como resultado de la expresión transgénica de al menso un ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, o de al menos un polipéptido expresado transgénicamente como se define en la reivindicación 22, o una molécula antisentido que contiene una secuencia complementaria a la de dicho ácido nucleico.

42. Una célula huésped que contiene al ácido nucleico expresado transgénicamente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, o el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29.

43. Una célula huésped de acuerdo a la reivindicación 42, escogida del grupo que consiste de una célula bacteriana, de insecto, de hongo, de levadura, de planta y de animal.

44. Un método para producir un polipéptido de la reivindicación 22 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 42 ó 43 bajo las condiciones que permitan la expresión del polipéptido y recuperar el polipéptido producido del cultivo.