PROCEDIMIENTO AUTOMATIZADO PARA DETECTAR ORGANISMOS PATÓGENOS EN AGUA.

Procedimiento para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra de agua,

que comprende la sucesión de las siguientes etapas: concentración de los organismos patógenos de una muestra de agua, en la que la concentración de los organismos patógenos se lleva a cabo por precipitación, coprecipitación o precipitación por inclusión, rotura con abertura de las células de los organismos patógenos, concentración de ADN y/o de ARN, por lo menos una amplificación de ácidos nucleicos, y una detección cualitativa y/o cuantitativa de ADN y/o ARN representativo de la contaminación del agua por dichos organismos patógenos; en el que todas las etapas secuenciales del procedimiento se controlan de manera completamente automática usando un sistema lógico de control

La presente invención se refiere al sector técnico general de la detección de organismos patógenos en agua.

En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento totalmente automatizado para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra de agua. La invención se refiere también a un dispositivo para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra de agua, para llevar a cabo este procedimiento. 5

La presencia de agentes patógenos en redes de suministro de agua, tales como redes de agua potable o aguas industriales, genera riesgos reales para la salud de los seres humanos. De este modo, las redes de suministro de agua, en gran parte, contienen organismos patógenos, tales como virus, bacterias, protozoos, hongos, amebas o gusanos, que son capaces de provocar varias enfermedades en los humanos. Entre estas enfermedades, se pueden mencionar, inter alia, el cólera, la fiebre tifoidea, la diarrea, la disentería, la legionelosis, o la gastroenteritis. 10

Entre los organismos patógenos responsables de dichas enfermedades, se pueden mencionar más particularmente los protozoos Cryptosporidium (parvum) y Giardia Lamblia, que se originan ambos en residuos fecales humanos y animales y que son una de las causas principales de enfermedades gastrointestinales, los protozoos Toxoplasma gondii y Naegleria fowleri, que se originan también en residuos fecales humanos y animales y que provocan varias enfermedades importantes, Cyclospora, que provocan diarrea, y bacterias coliformes, en particular Escherichia 15 coli, que se encuentran por toda la biosfera y cuya detección es importante ya que se considera que no son agentes patógenos típicos, sino organismos que indican la contaminación del agua, puesto que provocan enfermedades únicamente en concentraciones muy elevadas. En el contexto de la presente invención, con el fin de simplificarla, todos los organismos que indican contaminación del agua y todos los organismos patógenos realmente responsables de enfermedades en humanos se incluirán en la expresión “organismos patógenos”. Entre los organismos patógenos 20 responsables de enfermedades, se pueden mencionar también las bacterias Salmonella, incluyendo los serotipos S. enteridis, S. enterica, S. typhi y S. paratyphy, que son la causa del 70% de las enfermedades bacterianas de origen alimentario, en particular la fiebre tifoidea y la fiebre paratifoidea, y que son la causa de un número elevado de muertes, Heliobacter pylori, que es un organismo vinculado a la causa de por lo menos el 75% de todas las úlceras de estómago y a dos tipos de cáncer de estómago, y que es también la causa de un número elevado de muertes, y Legionnella, que 25 se encuentra en áreas naturales y también en sistemas de calentamiento de agua, y que provoca la enfermedad del legionario, y también virus de origen humano y animal, y, en particular, virus de hepatitis A, virus de tipo Norwalk, rotavirus, adenovirus, enterovirus y reovirus. Los virus Norwalk en particular provocan enfermedades gastrointestinales esporádicas y epidémicas con diarrea. En Estados Unidos, se detectaron aproximadamente 200.000 de estos últimos por año. 30

Dada la presencia de varios agentes patógenos en todas las redes de suministro de agua, estas últimas se deberían controlar y posiblemente desinfectar antes de que el agua proveniente de estas redes se pueda considerar como agua potable. Con respecto a las redes de aguas residuales o de suministro de agua de refrigeración, y también las redes de producción de energía, en particular, las redes de producción de energía nuclear, en ocasiones es necesario analizar el agua, e incluso desinfectarla, antes de que la misma se pueda reutilizar o desechar hacia el 35 entorno circundante.

La detección de la presencia de organismos patógenos, en particular la detección de organismos altamente patógenos de crecimiento lento, que son los más difíciles de detectar, representa por lo tanto un desafío importante en las áreas del tratamiento del agua, de la distribución del agua y del control de la calidad del agua. Las técnicas convencionales para detectar agentes patógenos, desarrolladas hasta la fecha, presentan varios inconvenientes: no se 40 usan continuamente o en tiempo real, tienen una sensibilidad relativamente baja con respecto a organismos patógenos y demuestran ser largas y caras en términos de material y personal.

Una primera técnica conocida usa el recuento de microorganismos que se desarrollan después de cultivar la muestra en varios medios nutrientes selectivos. Esta técnica es sencilla pero presenta riesgos considerables de error y de artefactos (especificidad deficiente de criterios morfológicos, ausencia de desarrollo de microorganismos de 45 crecimiento lento, crecimiento exponencial en el medio nutriente de cepas bacterianas que, en realidad, están en la fase de latencia del crecimiento en la muestra). Adicionalmente, su tiempo de respuesta es generalmente mayor que 24 horas.

Una segunda técnica, que usa la medición de una o más actividad/actividades enzimáticas, permite la cuantificación rápida de poblaciones de microorganismos vivos (microorganismos que se pueden cultivar y/o 50 microorganismos que se encuentran en forma viable pero que no se pueden cultivar) (WO 90/100983). Esta técnica en particular permite la monitorización de un conjunto de poblaciones, pero no posibilita la obtención de un grado muy preciso de especificidad.

Una tercera técnica, que usa sondas inmunológicas, tiene un tiempo de respuesta que es frecuentemente mayor que 24 horas, y normalmente carece de sensibilidad y especificidad (se pueden observar artefactos debidos a 55 reacciones cruzadas).

La patente US nº 6.187.530 da a conocer un automuestreador acuático para registrar la presencia de microorganismos en muestras de agua. El agua recogida se hace pasar a través de un filtro de disco y el filtrado se hace pasar a sensores químicos aguas abajo. Las partículas recogidas en el filtro de disco se pueden someter a uno o más reactivos para aplicar sondas moleculares que marcan especies específicas o provocan lisis celular in situ. Después de 60 descargar el filtro de disco, se examinan las células mediante microscopía electrónica.

Otras técnicas recientes usan sondas de oligonucleótidos específicas que en general se marcan para permitir su detección después de la hibridación con sus dianas. Se han desarrollado dos tipos principales de sonda de oligonucleótidos: sondas con ADN (o los ARNm que se corresponden con los mismos) como diana, y sondas con ARNr (ARN ribosómicos como diana). No obstante, las sondas con ADN o ARNm, aunque son potencialmente muy específicas, tienen el inconveniente de ser relativamente insensibles debido al bajo número de copias de ADN (o ARNm) 5 por célula microbiana.

Existe, por lo tanto, una necesidad de desarrollar un procedimiento y un dispositivo para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra de agua, no presentando dicho procedimiento y dicho dispositivo los inconvenientes de los planteamientos de la técnica anterior y posibilitando, por lo tanto, que se lleve a cabo la detección en continuo de varios microorganismos patógenos en el agua en un periodo de tiempo muy breve (menor que 6 horas), 10 de forma menos costosa y con una sensibilidad y una especificidad elevadas, haciendo que resulte posible obtener un límite de detección de 1 organismo en 100 ml de muestra de agua analizada y que se respeten, por lo tanto, las normativas impuestas sobre la calidad del agua potable.

La presente invención satisface esta necesidad. El presente solicitante ha descubierto por lo tanto, de forma sorpresiva, que esto se podría llevar a cabo con la ayuda de un procedimiento y un dispositivo, controlados de forma 15 completamente automática, que se pueden usar a escala industrial, preferentemente adoptando como base la técnica de amplificar ADN o ARN que usa una reacción en cadena de polimerasa (PCR), o una técnica similar.

Por lo tanto, el procedimiento según la presente invención está completamente automatizado y no contiene ninguna etapa manual. Se basa en la detección de secuencias de ADN o ARN específicas para ciertos microorganismos patógenos. En la técnica anterior ya se ha descrito la automatización de ciertas etapas individuales, pero hasta ahora no 20 se ha diseñado nunca la automatización de la totalidad de las etapas secuenciales del procedimiento según la presente invención. De este modo, la extracción sobre un soporte sólido y la purificación de ácidos nucleicos presentes en una muestra...

1. Procedimiento para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra de agua, que comprende la sucesión de las siguientes etapas:

concentración de los organismos patógenos de una muestra de agua, en la que la concentración de los organismos patógenos se lleva a cabo por precipitación, coprecipitación o precipitación por inclusión, 5

rotura con abertura de las células de los organismos patógenos,

concentración de ADN y/o de ARN,

por lo menos una amplificación de ácidos nucleicos, y

una detección cualitativa y/o cuantitativa de ADN y/o ARN representativo de la contaminación del agua por dichos organismos patógenos; en el que 10

todas las etapas secuenciales del procedimiento se controlan de manera completamente automática usando un sistema lógico de control.

2. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, caracterizado porque los organismos patógenos detectados son bacterias, virus, hongos y/o protozoos.

3. Procedimiento de detección según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el volumen de partida de la muestra 15 de agua es superior a 50 mililitros.

4. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo mediante una reacción en cadena de polimerasa en tiempo real.

5. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la concentración se lleva a cabo en presencia de iones de carbonato y metálicos divalentes seleccionados, de forma ventajosa, de entre el 20 grupo constituido por carbonato de calcio, carbonato de estroncio y carbonato de bario.

6. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la rotura con abertura de las células se lleva a cabo por molienda sobre perlas agitadas.

7. Procedimiento de detección según la reivindicación 6, caracterizado porque las perlas se agitan por ultrasonidos, por agitación mecánica o por vibración mecánica. 25

8. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, durante la rotura con abertura, o después de la rotura con abertura de las células y antes de la concentración de ADN y/o de ARN, se adicionan al medio de reacción que contiene las células por lo menos un agente caotrópico, de forma ventajosa una sal de guanidina, tal como tiocianato de guanidina, y por lo menos un agente de modificación de la adsorción, de forma ventajosa, un alcohol tal como etanol. 30

9. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración de ADN y/o de ARN se lleva a cabo por adsorción reversible de los ácidos nucleicos sobre un soporte sólido que contiene un material adsorbente, seguida por una elución de estos ácidos.

10. Procedimiento de detección según la reivindicación 9, caracterizado porque la elución de los ácidos nucleicos se lleva a cabo mediante lavado del material absorbente usando por lo menos un disolvente que contiene iones 35 monovalentes, de forma ventajosa seleccionados de entre el grupo constituido por tiocianato de sodio, tiocianato de potasio y EDTA.

11. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la detección de los organismos patógenos es una detección en continuo, de forma ventajosa llevada a cabo por fluorescencia, por luminiscencia o por espectrometría de masas. 40

12. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además una etapa de filtración previa.

13. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además una etapa previa para tratar la muestra de agua mediante choque térmico y/o mediante un estrés nutricional y/o adicionando un compuesto químico de inducción de genes con el fin de inducir el ARN de genes específicos y de 45 detectar los organismos patógenos viables en dicha muestra de agua.

14. Procedimiento de detección según la reivindicación 13, caracterizado porque el choque térmico se lleva a cabo mediante un impulso de calor durante menos de 3 horas.

15. Procedimiento de detección según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque el compuesto químico de inducción de genes es lactosa o IPTG para inducir el ARN lac Z. 50

16. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema lógico de control consta de un ordenador del tipo PC.

17. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los datos analíticos referentes a la detección de los organismos se transfieren automáticamente a un sistema de control central.

18. Procedimiento de detección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el procedimiento puede funcionar de manera continua y autónoma durante un periodo de tiempo mayor que o igual a un día, preferentemente desde tres días a más de siete días.

19. Dispositivo para detectar la presencia de organismos patógenos en una muestra de agua, que comprende:

una unidad para concentrar los organismos patógenos (1), 5

una unidad para romper células de los organismos patógenos (2),

una unidad para concentrar ADN y/o ARN (3),

una unidad para amplificar ácidos nucleicos (4), y

una unidad para detectar cualitativa y/o cuantitativamente ADN y/o ARN (5) representativo de la contaminación del agua por dichos organismos patógenos; 10

por lo menos un sistema lógico de control (6) que controla de forma completamente automática las etapas de tratamiento secuenciales llevadas a cabo por las unidades (1) a (5),

unos medios de bombeo (7),

unos medios automáticos de muestreo y distribución (8), y

un sistema de control central (9); 15

caracterizado porque la unidad para concentrar los organismos patógenos está adaptada para precipitación, coprecipitación o precipitación por inclusión.

20. Dispositivo de detección según la reivindicación 19, caracterizado porque la unidad para amplificar los ácidos nucleicos (4) consta de por lo menos una máquina termocicladora de reacción en cadena de polimerasa.

21. Dispositivo de detección según la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque la unidad para concentrar los 20 organismos patógenos (1) es un reactor realizado con metal, que comprende un sistema para introducir la muestra de agua, un sistema para introducir varios reactivos, un sistema de agitación, un sistema para evacuar el líquido sobrenadante, un sistema para evacuar el precipitado, de forma ventajosa situado en la parte inferior del reactor, y un sistema de calentamiento que, de forma ventajosa, consta de una camisa de calentamiento situada en torno al reactor.

22. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque la unidad para 25 romper las células (2) abriéndolas contiene un molino de perlas.

23. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque la unidad para concentrar ADN y/o ARN (3) comprende uno o más soporte(s) sólido(s) que contiene(n) un material de adsorción reversible para ácidos nucleicos, de forma ventajosa, un material vítreo.

24. Dispositivo de detección según la reivindicación 23, caracterizado porque los soportes sólidos están constituidos por 30 unas placas de microtitulación que contienen multipocillos, de forma ventajosa, placas de 60, 96 ó 384 pocillos.

25. Dispositivo de detección según la reivindicación 24, caracterizado porque los pocillos de las placas de microtitulación se usan solamente una vez y se mueven automáticamente para recibir la muestra de líquido que se origina en la unidad destinada a romper las células de los organismos abriéndolas.

26. Dispositivo de detección según la reivindicación 25, caracterizado porque el movimiento automático de los pocillos 35 se lleva a cabo usando un autómata.

27. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, caracterizado porque la unidad de detección (5) está constituida por un detector de fluorescencia, que comprende de forma ventajosa una cámara electrónica.

28. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, caracterizado porque la muestra que 40 contiene los organismos patógenos circula desde la unidad destinada a concentrar los organismos patógenos (1) hacia la entrada de la unidad destinada a amplificar los ácidos nucleicos (4), a través de las unidades destinadas a romper las células (2) abriéndolas y a concentrar los ácidos nucleicos (3), usando unos medios de bombeo (7) que, de forma ventajosa, están constituidos por unos tubos equipados con válvulas y/o bombas.

29. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 28, caracterizado porque después de que se 45 haya(n) concentrado el ADN y/o el ARN, los ácidos nucleicos se manipulan, desde la entrada de la unidad destinada a amplificar los ácidos nucleicos (4) hacia la salida de la unidad destinada a detectar los ácidos nucleicos (5), usando unos medios automáticos de muestreo y distribución (8) que, de forma ventajosa, están constituidos por un autómata.

30. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29, caracterizado porque el sistema lógico de control (6) consta de por lo menos un ordenador del tipo PC que controla el dispositivo completo. 50

31. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 30, caracterizado porque el sistema lógico de control (6) está comunicado por interfaz con una red para transferir, de forma automática o por demanda, los datos analíticos referentes a la detección de los organismos hacia un sistema de control central (9).

32. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31, caracterizado porque el sistema de

control central (9) consta de por lo menos un ordenador.

33. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 32, caracterizado porque el dispositivo contiene además un área de refrigeración (10) para almacenar los reactivos sensibles, preferentemente un bloque de refrigeración.

34. Dispositivo de detección según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 33, caracterizado porque el dispositivo está 5 conectado directamente a la red de suministro de agua potable para un muestreo automático.