PROCEDIMIENTO, APARATO Y PROGRAMAS INFORMÁTICOS PARA VERIFICAR LA INTEGRIDAD DE UNA SONDA.

Procedimientos, aparato y programas informáticos para verificar la integridad de una sonda ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ES 2 365 699 T3 Los procedimientos para amplificar ácidos nucleicos proporcionan herramientas útiles para la detección de patógenos humanos, detección de polimorfismos genéticos humanos, detección de ARN y secuencias de ADN, para la clonación molecular, secuenciación de ácidos nucleicos y similares. En particular, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en una herramienta importante en la clonación de secuencias de ADN, medicina forense, pruebas de paternidad, identificación de patógenos, diagnóstico de enfermedades y otros procedimientos útiles en los que se desea la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis y col., eds, 1990). La PCR permite la copia, y la amplificación resultante, de un ácido nucleico diana. Brevemente, un ácido nucleico diana, por ejemplo el ADN, se combina con un cebador de sentido directo y de sentido contrario, dNTP, ADN polimerasa y otros componentes de reacción. Véase Innis y col. El cebador de sentido directo puede hibridarse con la hebra codificante de una secuencia de ADN de interés. El cebador de sentido contrario puede hibridarse con la hebra codificante de la secuencia de ADN, en la dirección 3' de la localización en la que el cebador de sentido directo se hibrida con la diana de ADN. En la primera ronda de amplificación, la ADN polimerasa extiende los cebadores de sentido contrario y de sentido directo que están hibridados con el ácido nucleico diana. Las primeras hebras se sintetizan como hebras largas de longitud indiscriminada. En la segunda ronda de amplificación, los cebadores de sentido contrario y de sentido directo se hibridan con el ácido nucleico diana parental y con las secuencias complementarias en las hebras largas. Entonces, la ADN polimerasa extiende los cebadores hibridados para formar hebras de longitud discreta que son complementarias entre sí. Las rondas posteriores sirven para amplificar predominantemente las moléculas de ADN de longitud discreta. Las sondas de hibridación se usan actualmente para detectar y cuantificar ácidos nucleicos. Tales sondas son útiles para ensayos de hibridación que incluyen ensayos de hibridación in situ. Otro uso de estas sondas es para detectar y cuantificar productos de polinucleótidos de reacciones de amplificación. Hay muchos tipos diferentes de ensayos que emplean sondas de hibridación de ácidos nucleicos. Algunas de estas sondas generan señales con un cambio en la fluorescencia de un fluoróforo debido a un cambio en su interacción con otra molécula o resto. Normalmente, la interacción se provoca cambiando la distancia entre el fluoróforo y la molécula de interacción o resto. Estos ensayos se basan para la generación de señales en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o FRET. La FRET utiliza un cambio en la fluorescencia producido por un cambio en la distancia que separa un primer fluoróforo de un aceptor de energía de resonancia interactuante, tanto otro fluoróforo como un extintor de la fluorescencia. Las combinaciones de un fluoróforo y una molécula interactuante o resto, que incluye moléculas extintoras de la fluorescencia o restos, se conocen como pares de FRET. El mecanismo de la interacción de pares de FRET requiere que el espectro de absorción de un miembro del par se solape con el espectro de emisión del otro miembro, el primer fluoróforo. Si la molécula de interacción o resto es un extintor de la fluorescencia, su espectro de absorción debe solaparse con el espectro de emisión del fluoróforo. Stryer, L., Ann. Rev. Biochem. 1978, 47: 819-846; BIOPHYSICAL CHEMISTRY part II, Techniques for the Study of Biological Structure and Function (C. R. Cantor y P. R. Schimmel, eds., 1980), páginas 448-455, y Selvin, P. R., Methods in Enzymology 246: 300-335 (1995). Una interacción de FRET eficiente, o un grado sustancial de interacción de FRET, requiere que los espectros de absorción y emisión del par tengan un gran grado de solapamiento. La eficiencia de la interacción de FRET es linealmente proporcional al solapamiento. Haugland, R. P., Yguerabide, Jr., y Stryer, L., Proc. Natl. Acad Sci. USA 63: 24-30 (1969). También se han descrito sondas de no FRET. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.150.097. Un procedimiento para la detección de productos de amplificación es el ensayo de PCR de 5'-nucleasa (también denominado en lo sucesivo el ensayo TaqMan®) (Holland y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991); Lee y col., Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766 (1993)). Este ensayo detecta la acumulación de un producto de PCR específico por hibridación y escisión de una sonda fluorogénica doblemente marcada (la sonda TaqMan®) durante la reacción de amplificación. La sonda fluorogénica consiste en un oligonucleótido marcado con tanto un colorante de indicador fluorescente como un colorante de extintor de la fluorescencia. Durante la PCR, esta sonda es escindida por la actividad de 5'-exonucleasa de ADN polimerasa si, y solo si, se hibrida con el segmento que se amplifica. La escisión de la sonda genera un aumento en la intensidad de fluorescencia del colorante indicador. Otro procedimiento para detectar productos de amplificación que se basa en el uso de transferencia de energía es el procedimiento de sonda fluorescible descrito por Tyagi y Kramer (Nature Biotech. 14:303-309 (1996)), que también es el objeto de las patentes de EE.UU. nº 5.119.801 y 5.312.728. Este procedimiento emplea sondas de hibridación de oligonucleótidos que pueden formar estructuras de horquilla. En un extremo de la sonda de hibridación (tanto el extremo 5' como 3') hay un fluoróforo donante y en el otro extremo un resto aceptor. En el caso del procedimiento de Tyagi y Kramer, este resto aceptor es un extintor de la fluorescencia, es decir, el aceptor absorbe energía liberada por el donante, pero luego no fluoresce por sí mismo. Por tanto, si la sonda fluorescible está en la conformación 2 ES 2 365 699 T3 abierta, la fluorescencia del fluoróforo donante es detectable, mientras que si la sonda fluorescible está en la conformación de horquilla (cerrada), la fluorescencia del fluoróforo donante se extingue. Si se emplea en PCR, la sonda fluorescible molecular que se hibrida con una de las hebras del producto de PCR está en la conformación abierta, y la fluorescencia se detecta, mientras que aquellas que siguen sin hibridarse no fluorescerán (Tyagi y Kramer, Nature Biotechnol. 14: 303-306 (1996). Como resultado, la cantidad de fluorescencia aumentará a medida qua aumenta la cantidad de producto de PCR y, por tanto, puede usarse como una medida del progreso de la PCR. Para tener confianza en la señal, o ausencia de la misma, de una sonda de hibridación tal como aquella descrita anteriormente, el usuario debe controlar la integridad de la sonda. Por ejemplo, si el fluoróforo se ha escindido de la sonda, o el cuerpo del polinucleótido se ha escindido de la sonda, la fluorescencia no refleja con exactitud la cantidad de sonda que se une a una diana. Un control típico de la integridad de la sonda implica una mezcla de reacción separada que contiene una cantidad conocida de diana. Por tanto, si la sonda produce la señal apropiada para la muestra de control conocida, entonces se supone que la sonda está intacta. Esta técnica tiene al menos dos inconvenientes. Primero, no refleja la posibilidad de que las muestras que van a probarse, a diferencia del control, tengan enzimas que pudieran degradar las sondas en las muestras. Segundo, la técnica requiere el uso de un recipiente de reacción adicional. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de un procedimiento rápido y eficiente para determinar la integridad de una sonda de hibridación directamente en la propia muestra de prueba. La presente invención trata este y otros problemas. El documento US 6.174.670 describe procedimientos de monitorización de la hibridación durante la reacción en cadena de la polimerasa. Estos procedimientos se consiguen con un ciclado térmico rápido y el uso de colorantes de ADN bicatenario o sondas de hibridación específicas. Un par de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia comprende fluoresceína y Cy5 o Cy5.5. Los procedimientos para cuantificar el ADN amplificado y determinar su pureza se llevan a cabo por análisis de curvas de fusión y de rehibridación. El documento WO 97/46707 describe un procedimiento y dispositivo de ciclado térmico. El dispositivo comprende una cámara de muestra cuya temperatura puede modularse rápidamente y con exactitud durante un intervalo de temperaturas necesario para llevar a cabo varios... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de medición del carácter intacto de al menos una sonda para detectar un ácido nucleico diana en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento, (a) proporcionar una mezcla que comprende al menos una sonda de autohibridación, sonda que puede hibridarse con el ácido nucleico diana; (b) medir una señal fluorescente de la sonda cuando la sonda no está hibridada con el ácido nucleico diana en uno o más instantes de tiempo seleccionados del grupo que consiste en un primer, segundo y tercer instante de tiempo, estando la temperatura de la mezcla a o por debajo de la temperatura de autohibridación de la sonda en un primer instante de tiempo, habiéndose elevado la temperatura de la mezcla a una temperatura por encima de la temperatura de autohibridación de la sonda en un segundo instante de tiempo y habiéndose reducido la temperatura de la mezcla a una temperatura a o por debajo de la temperatura de autohibridación de la sonda en un tercer instante de tiempo; y (c) determinar el carácter intacto de la sonda comparando la señal de la sonda en el uno o más instantes de tiempo con al menos un valor umbral predeterminado indicativo de la señal de la sonda cuando la sonda está intacta; en el que la sonda comprende un fluoróforo y un agente extintor de la fluorescencia, y el calentamiento de la sonda de una temperatura por debajo de la temperatura de autohibridación de la sonda a una temperatura por encima de la temperatura de autohibridación de la sonda hace que la sonda cambie la conformación de una primera conformación de autohibridación a una segunda conformación, cambiando así la distancia entre el fluoróforo y el agente extintor de la fluorescencia de forma que la fluorescencia del fluoróforo se extingue en la primera conformación en comparación con la fluorescencia del fluoróforo en la segunda conformación. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende además medir la señal de la sonda en dos o más instantes de tiempo; y la etapa (c) comprende además determinar la integridad de la sonda comparando la diferencia en la señal de la sonda en los dos o más instantes de tiempo con el al menos un valor umbral. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende medir la fluorescencia de la sonda en el primer o tercer instante de tiempo. 4. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende medir la fluorescencia de la sonda en el segundo instante de tiempo. 5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa determinante comprende comparar la fluorescencia de la sonda en el primer y tercer instante de tiempo con al menos un valor umbral indicativo de la señal de la sonda cuando la sonda está intacta. 6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa determinante comprende comparar la fluorescencia de la sonda en el segundo y tercer instante de tiempo con al menos un valor umbral indicativo de la señal de la sonda cuando la sonda está intacta. 7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa determinante comprende comparar la diferencia de fluorescencia de la sonda en el primer y segundo instante de tiempo con el valor umbral indicativo de la señal cuando la sonda está intacta. 8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de medición comprende medir la fluorescencia de la sonda en el tercer instante de tiempo. 9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa determinante comprende comparar la señal en los dos o más instantes de tiempo con dos o más valores umbral indicativos de la señal de la sonda cuando la sonda está intacta. 10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda comprende un oligonucleótido marcado con un fluoróforo y un agente extintor de la fluorescencia de forma que la sonda es escindida por la actividad de 5'exonucleasa de una ADN polimerasa cuando la sonda se hibrida con un ácido nucleico amplificado emitiendo así la fluorescencia. 11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda es una sonda fluorescible molecular. 12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos parte del procedimiento se realiza durante una reacción de amplificación, comprendiendo la reacción de amplificación (a) combinar en una mezcla acuosa: (i) una sonda diana, una primera sonda de control y una segunda sonda de control; (ii) un primer cebador de 5', un primer cebador de 3' y un molde diana, comprendiendo el molde diana un sitio de hibridación para el primer cebador de 5', el primer cebador de 3' y la sonda diana; (iii) un primer molde de control, comprendiendo el primer molde de control un sitio de hibridación para el 22 ES 2 365 699 T3 primer cebador de 5', el primer cebador de 3' y la primera sonda de control; y (iv) un segundo cebador de 5', un segundo cebador de 3' y un segundo molde de control, comprendiendo el segundo molde de control un sitio de hibridación para el segundo cebador de 5, el segundo cebador de 3', la sonda diana y una segunda sonda de control; (b) realizar una reacción de amplificación para crear productos de amplificación; y (c) cuantificar la unión de la sonda diana, la primera sonda de control y la segunda sonda de control a los productos de amplificación. 13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento se pone en práctica en al menos dos sondas diferentes en la mezcla, en el que las sondas se diseñan para hibridarse con diferentes secuencias de ácidos nucleicos. 14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la mezcla comprende además un colorante, comprendiendo el procedimiento además medir una señal del colorante y normalizar la señal de la sonda a la señal del colorante. 23 ES 2 365 699 T3 24 ES 2 365 699 T3 ES 2 365 699 T3 26 ES 2 365 699 T3 27 ES 2 365 699 T3 28 ES 2 365 699 T3 29 ES 2 365 699 T3 ES 2 365 699 T3 31 ES 2 365 699 T3 32 ES 2 365 699 T3 33 ES 2 365 699 T3 34 ES 2 365 699 T3 ES 2 365 699 T3 36 ES 2 365 699 T3 37 ES 2 365 699 T3 38 ES 2 365 699 T3 39 ES 2 365 699 T3