Un poli(beta-amino-éster) preparado a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina,

en el que la amina se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas 6-94: y sus derivados y sales

Poli(β-amino-ésteres) biodegradables y usos de los mismos.

Apoyo gubernamental

El trabajo descrito en el presente documento fue apoyado, en parte, por subvenciones de la National Science Foundation (acuerdo cooperativo nº ECC9843342 con el MIT Biotechnology Process Engineering Center), los National Institutes of Health (GM26698; NRSA beca de investigación nº 1 F32 GM20227-01), y el Department of the Army (acuerdo cooperativo nº DAMD 17-99-2-9-001 con el Center for Innovative Minimally Invasive Therapy). El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la invención

El tratamiento de enfermedades humanas a través de la aplicación de fármacos a base de nucleótidos tales como ADN y ARN tiene el potencial para revolucionar el campo médico (Anderson Nature 392 (supl.):25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2:144-147, 1996; Crystal Science 270:404-410, 1995; Mulligan Science 260:926-932, 1993). Hasta ahora, el uso de virus modificados como vectores de transferencia génica ha representado generalmente el enfoque clínicamente más satisfactorio para la terapia génica. Aunque los vectores virales son actualmente los agentes de transferencia génica más eficaces, problemas referentes a la seguridad global de los vectores virales, que incluyen el potencial para respuestas inmunitarias no buscadas, han dado como resultado esfuerzos paralelos para desarrollar alternativas no virales (para referencias destacadas, véase: Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993).

Las alternativas actuales a los vectores virales incluyen sistemas de administración poliméricos (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995), formulaciones liposómicas (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785, 1998; Hope y otros, Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh y otros, New J. Chem. 21:113-124, 1997), y protocolos de inyección de ADN "desnudo" (Sanford Trends Biotechnol. 6:288-302, 1988).

Aunque estas estrategias tienen que conseguir aún la eficacia clínica de los vectores virales, la seguridad potencial, el procesamiento y los beneficios económicos ofrecidos por estos métodos (Anderson Nature 392 (supl.):25-30, 1996) han avivado el interés en el desarrollo continuado de enfoques no virales para la terapia génica (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993).

Se han usado ampliamente polímeros catiónicos como vectores de transfección debido a la facilidad con la que condensan y protegen hebras de ADN cargadas negativamente. Los polímeros que contienen amina tales como poli(lisina) (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6.-7-20, 1995), poli(etilenimina) (PEI) (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995) y dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993) están cargados positivamente a pH fisiológico, forman pares iónicos con ácidos nucleicos y median la transfección en una variedad de líneas celulares. Sin embargo, a pesar de su uso común, los polímeros catiónicos tales como poli(lisina) y PEI pueden ser significativamente citotóxicos (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Deshmukh y otros, New J. Chem. 21;113-124, 1997; Choksakulnimitr y otros, Controlled Release 34:233-241, 1995; Brazeau y otros, Pharm. Res. 15:680-684, 1998). Como resultado, la elección de un polímero catiónico para una aplicación de transferencia génica requiere generalmente un equilibrio entre eficiencia de transfección y citotoxicidad a corto y largo plazo. Adicionalmente, la biocompatibilidad a largo plazo de estos polímeros sigue siendo una cuestión importante para su uso en aplicaciones terapéuticas in vivo, puesto que varios de estos polímeros no son fácilmente biodegradables (Uhrich Trends Polim. Sci. 5:388-393, 1997; Roberts y otros, J. Biomed. Mater. Res. 30:53-65, 1996).

Con el fin de desarrollar alternativas seguras a los vectores poliméricos existentes y otros biomateriales funcionalizados, se han desarrollado poliésteres degradables que portan cadenas laterales catiónicas (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon y otros, Macromolecules 22:3250-3255, 1989; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Zhou y otros, Macromolecules 23:3399-3406, 1990). Los ejemplos de estos polímeros incluyen poli(L-lactida-co-L-lisina) (Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), poli(éster de serina) (Zhou y otros, Macromolecules 23:3399-3406, 1990), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) y, más recientemente, poli[ácido α-(4-aminobutil)-L-glicólico]. Recientemente se demostró que el poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y el poli[ácido α-(4-aminobutil)-L-glicólico] condensaban el ADN de plásmido a través de interacciones electrostáticas, y que mediaban la transferencia génica (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:S633-5639, 1999). De manera importante, estos nuevos polímeros son significativamente menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI, y se degradan dando metabolitos no tóxicos. Queda claro a partir de estas investigaciones que el diseño racional de poliésteres que contienen amina puede ser una vía productiva para el desarrollo de vectores de transfección eficaces y seguros. Sin embargo, desafortunadamente, las presentes síntesis de estos polímeros requieren o bien la preparación independiente de monómeros especializados (Barrera y otros, J, Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), o bien el uso de cantidades estequiométricas de agentes de acoplamiento caros (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999). Adicionalmente, las funcionalidades amina en los monómeros deben protegerse antes de la polimerización (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121;5633-5639, 1999; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon y otros, Macromolecules 22:3250-3255, 1989), necesitándose etapas de desprotección tras la polimerización adicionales antes de que los polímeros puedan usarse como agentes de transfección.

Existe una necesidad continua de polímeros no tóxicos, biodegradables, biocompatibles que puedan usarse para transfectar ácidos nucleicos y que se preparen fácilmente de manera económica y eficaz. Tales polímeros tendrían varios usos, incluyendo la administración de ácidos nucleicos en la terapia génica así como en el empaquetamiento y/o administración de agentes de diagnóstico, terapéuticos y profilácticos.

Sumario de la invención

La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona polímeros útiles en la preparación de dispositivos de administración de fármacos y composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención también proporciona métodos de preparación de los polímeros y métodos de preparación de microesferas y otras composiciones farmacéuticas que contienen los polímeros de la invención.

Los polímeros de la presente invención son poli(β-amino-ésteres) y sales y derivados de los mismos. Los polímeros preferidos son biodegradables y biocompatibles. Normalmente, los polímeros tienen una o más aminas terciarias en la estructura principal del polímero. Los polímeros preferidos tienen una o dos aminas terciarias por unidad de repetición de la estructura principal. Los polímeros también pueden ser copolímeros en los que uno de los componentes es un poli(β-amino-éster). Los polímeros de la invención pueden prepararse fácilmente condensando bis(aminas secundarias) o aminas primarias con bis(ésteres de acrilato).

Un polímero de la presente invención se prepara a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, seleccionándose la amina del grupo que consiste en las fórmulas...

1. Un poli(beta-amino-éster) preparado a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, en el que la amina se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas 6-94:

y sus derivados y sales.

2. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

3. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

4. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

5. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

6. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

7. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

8. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

9. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

10. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:

11. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que el acrilato es de fórmula A-PP:

12. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:

13. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:

14. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:

15. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:

16. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el poli(beta-amino-éster) se selecciona del grupo que consiste en: C86, D60, D61, U94, LL6, C94, F94, JJ94, JJ86, C86, U86, E86, B17, D70, U87, D87, C94, D86, F86, AA94, AA60, A61, D94, U94, E94, B17, M17 y AA61.

17. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, de fórmula:

en el que n es un número entero entre 3 y 10.000; y sus derivados y sales.

18. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, de fórmula:

en el que n es un número entero entre 3 y 10.000; y sus derivados y sales.

19. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, de fórmula:

en el que n es un número entero entre 3 y 10.000; y sus derivados y sales.

20. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, de fórmula:

preparado por adición conjugada de una amina primaria

a un bis(éster de acrilato)

en el que la amina primaria es de fórmula:

en donde:

R₁ se proporciona mediante las aminas primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76, 77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;

B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;

n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol y derivados y sales del mismo.

21. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 20, en el que la amina es de fórmula:

22. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, de fórmula

preparado por adición conjugada de una bis(amina secundaria)

a un bis(éster de acrilato)

en el que la bis(amina secundaria) es de fórmula:

en donde:

R₁, R₂ y A se proporcionan mediante la bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71;

cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó 71, R₁ y R₂ están unidos formando una estructura cíclica con A;

B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;

n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol y derivados y sales del mismo.

23. El poli(beta-amino-éster) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el polímero está terminado en amina.

24. El poli(beta-amino-éster) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el polímero está terminado en acrilato.

25. Una composición que comprende:

un poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1,

un polinucleótido, y

un agente co-complejante seleccionado del grupo que consiste en polímeros catiónicos, proteínas catiónicas, PLGA, espermina, espermidina, poliaminas, polietilenimina (PEI) y polilisina (PLL).

26. La composición según la reivindicación 25, en la que la razón de agente co-complejante con respecto a polinucleótido oscila desde 0,1 hasta 1,2 (p/p/p).

27. La composición según la reivindicación 25, en la que la razón de poli(beta-amino-éster) con respecto a polinucleótido oscila desde 10 hasta 120.

28. Un método de síntesis de un poli(β-amino-éster) según la reivindicación 1, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar una amina primaria o bis(amina secundaria) seleccionada del grupo que consiste en las fórmulas 6, 7, 16-18, 37-39, 41, 47, 51, 60-74, 76, 77, 83, 84, 86-89, 92 y 94 según la reivindicación 1;

proporcionar un bis(éster de acrilato); y

hacer reaccionar la amina y el bis(éster de acrilato) en condiciones adecuadas para formar el poli(β-amino-éster).

29. El método según la reivindicación 28, en el que la amina es de fórmula:

30. El método según la reivindicación 28, que comprende además la etapa de examinar el polímero para determinar una característica deseada, en el que el poli(β-amino-éster) no se precipita, purifica ni aísla antes de la etapa de examinar.

31. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) en un disolvente orgánico.

32. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) en ausencia de un disolvente.

33. El método según la reivindicación 28, en el que el disolvente orgánico se selecciona del grupo que consiste en THF, dietil éter, glima, hexanos, metanol, etanol, isopropanol, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, dimetilformamida, acetonitrilo, benceno, DMSO y tolueno.

34. El método según la reivindicación 28, en el que el disolvente orgánico es DMSO.

35. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 0,01 M y 5 M.

36. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 0,1 M y 2 M.

37. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 1 M y 2 M.

38. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre aproximadamente 0,01 M y 5 M.

39. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre aproximadamente 0,1 M y 2 M.

40. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre aproximadamente 1 M y 2 M.

41. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 0 y 75ºC.

42. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 20 y 50ºC.

43. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 30 y 60ºC.

44. Un método de encapsulación de un agente en una matriz de poli(β-amino-ésteres) para formar micropartículas, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar un agente;

proporcionar un poli(β-amino-éster) según la reivindicación 1; y

poner en contacto el agente y el poli(β-amino-éster) en condiciones adecuadas para formar micropartículas.

45. El método según la reivindicación 44, en el que el agente es un polinucleótido.

46. El método según la reivindicación 45, en el que el polinucleótido es ADN.

47. El método según la reivindicación 45, en el que el polinucleótido es ARN.

48. El método según la reivindicación 44, en el que el agente es una molécula pequeña.

49. El método según la reivindicación 44, en el que el agente es una proteína.

50. El método según la reivindicación 44, en el que la etapa de poner en contacto comprende secar por pulverización una mezcla del agente y el poli(β-amino-éster).

51. El método según la reivindicación 44, en el que la etapa de poner en contacto comprende técnicas doble emulsión - evaporación del disolvente.

52. El método según la reivindicación 44, en el que la etapa de poner en contacto comprende una técnica de inversión de fases.

53. Un método de examinar una biblioteca de polímeros, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar una pluralidad de polímeros, siendo los polímeros poli(beta-amino-ésteres) según la reivindicación 1; y

examinar los polímeros para determinar una propiedad deseada útil en terapia génica.

54. El método según la reivindicación 53, en el que la etapa de proporcionar comprende sintetizar los polímeros en paralelo.

55. El método según la reivindicación 54, en el que la etapa de sintetizar comprende sintetizar los polímeros en DMSO.

56. El método según la reivindicación 54, en el que la etapa de sintetizar no incluye precipitar, purificar ni aislar el polímero antes de la etapa de examinar.

57. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 500 poli(beta-amino-ésteres).

58. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 1000 poli(beta-amino-ésteres).

59. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 1500 poli(beta-amino-ésteres).

60. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 2000 poli(beta-amino-ésteres).

61. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es una capacidad para unirse a un polinucleótido.

62. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa.

63. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa a un pH inferior a 7.

64. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa a pH 5 y no ser soluble en una disolución acuosa a pH 7.

65. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para unirse a heparina.

66. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para aumentar la eficiencia de transfección.

67. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es útil en la ingeniería de tejidos.

68. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar al crecimiento celular.

69. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar a la unión celular.

70. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar al crecimiento tisular.

71. Un método de examinar una colección de poli(beta-amino-ésteres), comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar una pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) según la reivindicación 1;

proporcionar un polinucleótido que incluye un gen indicador;

proporcionar células;

poner en contacto cada uno de los polímeros con el polinucleótido dando como resultado una mezcla de polinucleótido:polímero;

poner en contacto las células con la mezcla de polinucleótido:polímero; y

determinar si las células expresan el gen indicador.

72. El método según la reivindicación 71, en el que la etapa de proporcionar una pluralidad de polímeros comprende sintetizar los polímeros en paralelo.

73. El método según la reivindicación 71, en el que la pluralidad de polímeros comprende al menos 500 polímeros diferentes.

74. El método según la reivindicación 71, en el que la pluralidad de polímeros comprende al menos 1000 polímeros diferentes.

75. El método según la reivindicación 71, en el que el gen indicador codifica para la proteína fluorescente verde.

76. El método según la reivindicación 71, en el que las células son células de mamífero.

77. El método según la reivindicación 71, en el que las células son células bacterianas.

78. El método según la reivindicación 71, en el que las células son células COS-7.

79. El método según la reivindicación 71, en el que la razón de polímero con respecto a polinucleótido es de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1 y 200:1.

80. El método según la reivindicación 71, en el que la etapa de determinar comprende cuantificar la cantidad de expresión del gen indicador.