NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS LIGADAS A UN LIGANDO.

Una nanopartícula magnética que tiene un núcleo que es un material compuesto que comprende átomos de metal pasivo y átomos de metal magnético,

en la que la relación de átomos de metal pasivo con respecto a átomos de metal magnético en el núcleo está entre 5:0,1 y 2:5 y los átomos de metal pasivo son átomos de oro, platino, plata o cobre y los átomos de metal magnético son átomos de hierro, cobalto o gadolinio, y en la que el núcleo está covalentemente ligado a una pluralidad de ligandos, al menos uno de los cuales comprende un grupo hidrato de carbono

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nanopartículas magnéticas, y en particular a nanopartículas magnéticas que tienen ligandos inmovilizados y a su uso en el estudio de la interacción de estos ligandos con otras 5 especies. La presente invención se refiere además a aplicaciones de las nanopartículas, por ejemplo, para cribado, diagnóstico y terapia.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de metodologías para producir nanopartículas con propiedades biosensibles ha abierto el camino para producir herramientas útiles para los diagnósticos moleculares, la terapéutica y la biotecnología [1]. Las 10 nanopartículas coloidales metálicas, semiconductoras y magnéticas son actualmente objeto de un intenso estudio para posibles aplicaciones [2].

Se han fabricado nanopartículas que contienen materiales paramagnéticos tales como óxido de hierro que presentan propiedades magnéticas excepcionalmente fuertes bajo campos magnéticos externos. Estas nanopartículas magnéticas pueden usarse en muchas aplicaciones biomédicas que incluyen separación de células, 15 marcado de células y de tejidos in vivo, mejora del contraste en la obtención de imágenes de resonancia magnética, elección de tumores como diana, terapias de hipertermia y administración de fármacos.

Para tales aplicaciones, las nanopartículas deberán ser preferentemente suficientemente pequeñas para evitar provocar una respuesta inmunitaria y ser captadas por células, si es necesario. También es útil si el tamaño de las partículas puede controlarse, ya que las partículas deberán ser de aproximadamente el mismo 20 tamaño de forma que muestren las mismas propiedades magnéticas. Las partículas también deberán ser preferentemente químicamente estables de forma que no sean descompuestas por el cuerpo.

También se prefiere que las nanopartículas magnéticas para uso en biomedicina sean solubles, especialmente en agua, con el fin de que puedan almacenarse y administrarse eficazmente. Idealmente, tales partículas serían estables en disolución y no se agregarían, tanto cuando se almacenaran antes de uso como en el 25 cuerpo. Las nanopartículas magnéticas tienden a aglutinarse juntas en disolución debido a que se atraen entre sí. Si esto ocurriera en el cuerpo, obstaculizaría la circulación sanguínea y posiblemente sería peligroso; en disolución coloidal harían que el coloide fuera difícil de usar.

Previamente, las partículas de óxido de hierro comercialmente disponibles se han usado en clasificación y separación de células [3]. Las nanopartículas magnéticas monodispersas de Fe/Pt [4], Co y Co/Fe [5], 30 Fe [6] y óxidos de hierro [7] se han sintetizado recientemente por química de disolución para aplicaciones en materiales [8]. También se han descrito nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con dextrano reticulado para evitar aglutinización, véase por ejemplo el documento WO 03/005029.

Idealmente, las nanopartículas magnéticas están fabricadas de metal magnético elemental en vez de óxido metálico ya que el metal elemental es un mejor potenciador de la obtención de imágenes magnéticas. Sin 35 embargo, tales nanopartículas son frecuentemente químicamente inestables, ya que el metal puede oxidarse. Una posibilidad para aumentar la estabilidad química de las nanopartículas magnéticas es sintetizarlas a partir de un metal magnético con un metal pasivo para estabilizar el metal magnético.

El documento US 2002/0068187 desvela nanopartículas con núcleo-envoltura de oro-hierro protegidas con tensioactivo sintetizadas por medio de micelas inversas. Sin embargo, este procedimiento es complejo, 40 requiriendo tres etapas de síntesis. La composición multicapa de las partículas resultantes también aumenta el límite de tamaño inferior para las partículas, que puede ser una desventaja si se requieren partículas muy pequeñas [14].

La patente de EE.UU. nº: 6.254.662 desvela el uso de nanopartículas de aleaciones de FePt y CoPt para formar finas películas nanocristalinas sobre una superficie sólida para uso en la fabricación de medios de grabación de densidad ultra-alta. Otros usos de las películas se mencionan en la patente, que incluyen el uso como 45 películas de polarización magnética y puntas magnéticas para microscopía de fuerza magnética, pero no se prevén aplicaciones biomédicas.

Para muchas de las aplicaciones descritas anteriormente es necesario ligar las nanopartículas a moléculas biológicamente activas tales como ligandos que se unen a moléculas intracelulares o extracelulares. Tales ligandos pueden ser, por ejemplo, hidrato de carbono, ácido nucleico o proteína. 50

La patente de EE.UU. nº: 6.514.481 desvela nanopartículas de óxido de hierro recubiertas con una envoltura de sílice en las que la envoltura está ligada a una molécula que elige diana tal como un péptido mediante una molécula espaciadora. Los documentos WO 02/098364 y WO 01/19405 desvelan nanopartículas magnéticas de óxido metálico recubiertas con dextrano y funcionalizadas con péptidos y oligonucleótidos.

Se han usado estrategias similares para preparar nanopartículas para el marcado intracelular [9] y como 5 nanosensores [10]. Todos estos procedimientos son procedimientos de múltiples etapas que requieren mucho tiempo que requieren que las nanopartículas se recubran con dextrano o sílice, que las nanopartículas recubiertas se funcionalicen de forma que se unan al ligando, y finalmente que el ligando se una a las nanopartículas.

El documento WO 03/073444 desvela nanopartículas superparamagnéticas que tienen un núcleo formado de átomos de los metales Au y Fe en una relación de al menos 3:7. La solicitud dice que los ligandos 10 pueden ligarse al núcleo mediante un grupo sulfuro y que las nanopartículas se usan para formar dispositivos nanoelectrónicos. Los núcleos de las nanopartículas tienen diámetros en el intervalo de 5 nm a 50 nm.

El documento WO 02/093140 desvela nanoalambres magnéticos que comprenden uno o más segmentos y grupos funcionales o ligandos asociados a al menos uno de dichos segmentos. Los nanoalambres tienen un diámetro en el intervalo de aproximadamente 10-300 nm y una longitud de 10 nm a decenas de 15 micrómetros. Los segmentos de los nanoalambres pueden formarse a partir de materiales tales como oro, plata, platino, cobre, hierro y cobalto en forma pura o aleada y los grupos funcionales pueden ser átomos o grupos de átomos que pueden tener más reactividad química tal como reaccionar con un ligando para unir el ligando al alambre, o para unirse a una molécula diana.

Aunque se propone una variedad de posibles formas de asociar los ligandos y los nanoalambres, los ejemplos se 20 basan en la interacción iónica entre ligandos que contienen grupos ácido carboxílico y el nanoalambre.

La patente de EE.UU. nº: 6.531.304 desvela un coloide a escala nanométrica formado a partir de aleaciones metálicas que se hace reaccionar y se une no covalentemente a un “modificador” de polisacárido o de azúcar.

El documento WO 02/32404 desvela nano-herramientas solubles en agua para estudiar interacciones 25 mediadas por hidratos de carbono [11], [12]. Estas herramientas son gliconanopartículas de oro y gliconanopuntos de sulfuro de cadmio que incorporan antígenos de hidrato de carbono. Estos nanopuntos de oro y semiconductores solubles en agua son estables durante meses en disoluciones fisiológicas y presentan tamaños de núcleo excepcionalmente pequeños. Son resistentes a glicosidasas y no presentan citotoxicidad. También son plataformas útiles para estudios básicos de interacciones de hidratos de carbono [13] y son herramientas para aplicaciones 30 biotecnológicas y biomédicas. Sin embargo, estas nanopartículas no son magnéticas.

El documento WO 99/61911 desvela nanopartículas en las que un núcleo de metal o aleación de metales tiene una monocapa adsorbida sobre él, incluyendo la monocapa el sustituyente reactivo para acoplar ligandos.

Teranishi y col. (Gold, 978-982, 2003) describen estudios de las propiedades ópticas y eléctricas de 35 super-redes cristalinas de nanopartículas de oro.

Srikanth y col. (Materials Science and Engineering, 901-904, 2001) describen nanopartículas que se sintetizan como una “nano-cebolla”...

1. Una nanopartícula magnética que tiene un núcleo que es un material compuesto que comprende átomos de metal pasivo y átomos de metal magnético, en la que la relación de átomos de metal pasivo con respecto a átomos de metal magnético en el núcleo está entre 5:0,1 y 2:5 y los átomos de metal pasivo son átomos de oro, platino, plata o cobre y los átomos de metal magnético son átomos de hierro, cobalto o gadolinio, y en la que el 5 núcleo está covalentemente ligado a una pluralidad de ligandos, al menos uno de los cuales comprende un grupo hidrato de carbono.

2. La nanopartícula magnética de la reivindicación 1, en la que el núcleo de la nanopartícula tiene un diámetro medio inferior a 5 nm.

3. La nanopartícula magnética de una cualquiera de la reivindicación precedente 1 o la reivindicación 2, 10 en la que el núcleo está formado a partir átomos de Au/Fe, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd o Au/Fe/Cu/Gd.

4. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la relación de átomos de metal pasivo con respecto a átomos de metal magnético en el núcleo está entre 5:0,1 y 5:1.

5. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el metal pasivo es oro y el metal magnético es hierro. 15

6. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos uno de los ligandos incorpora un lantánido.

7. La nanopartícula magnética de la reivindicación 6, en la que el lantánido es gadolinio.

8. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula comprende un átomo activo para RMN. 20

9. La nanopartícula magnética de la reivindicación 8, en la que los átomos activos para RMN son Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 o un lantánido+3.

10. La nanopartícula magnética de la reivindicación 1, en la que el grupo hidrato de carbono comprende un grupo polisacárido, oligosacárido o monosacárido.

11. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al 25 menos uno de los ligandos comprende un glicanoconjugado.

12. La nanopartícula magnética de la reivindicación 11, en la que el glicanoconjugado es un glicolípido o una glicoproteína.

13. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos uno de los ligandos está ligado al núcleo mediante un grupo sulfuro. 30

14. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula comprende una marca.

15. La nanopartícula magnética de la reivindicación 14, en la que la marca es un grupo fluorescente o un isótopo radiactivo o un átomo activo para RMN.

16. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al 35 menos uno de los ligandos comprende un péptido o una proteína.

17. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que al menos uno de los ligandos comprende una molécula de ácido nucleico.

18. La nanopartícula magnética de la reivindicación 17, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN o de ARN, o un ligando de ARNip o de miARN. 40

19. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula comprende un componente farmacéuticamente activo.

20. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el núcleo está ligado a al menos 20 ligandos.

21. La nanopartícula magnética de la reivindicación 20, en la que el núcleo está ligado a al menos 50 45 ligandos.

22. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, la nanopartícula es soluble en agua.

23. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende una pluralidad de especies de grupo de ligandos.

24. La nanopartícula magnética de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que los 5 ligandos están covalentemente unidos al núcleo por un grupo ligador.

25. La nanopartícula magnética de la reivindicación 24, en la que el grupo ligador comprende un grupo disulfuro.

26. Una composición que comprende una población de una o más de las nanopartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25. 10

27. La composición de la reivindicación 26 que comprende una pluralidad de nanopartículas que tienen diferentes grupos de ligandos.

28. Una composición que comprende una población de una o más de las nanopartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para uso en terapia.

29. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, cuya composición es un coloide. 15

30. El coloide de la reivindicación 29, en el que las nanopartículas tienen un diámetro medio inferior a 2 nm; y/o en el que el coloide es estable durante al menos aproximadamente 1 año.

31. Una nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30 para uso en un procedimiento para vacunar un paciente con un antígeno, en la que el ligando unido al núcleo de la nanopartícula comprende el antígeno. 20

32. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento según la reivindicación 31, en la que la vacuna se administra por aplicación de un campo magnético.

33. Una nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31 para uso en un procedimiento para vacunar un paciente con ácido nucleico que codifica un antígeno, en la que el ligando unido al núcleo de la nanopartícula comprende el ácido 25 nucleico

34. Uso de una nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30 como agente de contraste para la obtención de imágenes de resonancia magnética.

35. El uso de la reivindicación 34, en el que el reactivo es para uso en la obtención de imágenes de los 30 pulmones de un paciente.

36. El uso de la reivindicación 35, en el que el reactivo de obtención de imágenes es para uso en el diagnóstico o el tratamiento de asma y enfisema.

37. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en el que las nanopartículas comprenden gadolinio y tienen un diámetro de núcleo inferior a 1,0 nm. 35

38. Una nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30 para uso en un procedimiento para tratar cáncer.

39. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento de la reivindicación 38, en la que el cáncer es un tumor.

40. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento de la reivindicación 39, en la que el 40 tumor se expone a un campo magnético de alta frecuencia o el tumor se expone a luz infrarroja para calentar las nanopartículas y destruir tejido tumoral.

41. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, en la que la nanopartícula comprende un ligando que es un antígeno asociado a tumor o factor autocrino tumoral. 45

42. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 41, en la que el ligando es un hidrato de carbono.

43. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 42, en la que el tratamiento de cáncer es la inhibición de metástasis.

44. La nanopartícula o composición para uso en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 43, en la que los ligandos comprenden un hidrato de carbono con especificidad o afinidad por metástasis, una hormona, DHEA, un péptido que puede unirse a un receptor específico de célula, un lípido para 5 unirse a un receptor toll o azul de metileno para unirse a células de melanoma metastatizantes.

45. Una nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30 para uso en un procedimiento para la recuperación miocárdica.

46. Un procedimiento de preparación de nanopartículas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que las nanopartículas comprenden un núcleo que comprende átomos de oro y opcionalmente átomos de 10 hierro, núcleo que está covalentemente ligado a una pluralidad de ligandos, comprendiendo el procedimiento:

(a) sintetizar un derivado de sulfuro del ligando; y

(b) hacer reaccionar el ligando derivatizado de sulfuro con HAuCl4 (ácido tetracloroáurico), y opcionalmente con una sal férrica en la que los átomos de hierro están presentes en el núcleo, en presencia de un agente reductor para producir las partículas. 15

47. El procedimiento de la reivindicación 46, en el que la etapa (b) comprende derivatizar el ligando con un ligador.

48. El procedimiento de la reivindicación 47, en el que el ligador es un ligador de disulfuro.

49. El procedimiento de la reivindicación 48, en el que el grupo de ligador de disulfuro está representado por la fórmula general HO-(CH2)n-S-S-(CH2)m-OH en la que n y m son independientemente números enteros entre 1 20 y 5.

50. El procedimiento de la reivindicación 48, en el que el ligando está derivatizado como un disulfuro protegido.

51. Un procedimiento ex vivo de interrumpir una interacción entre un hidrato de carbono y un componente de unión, comprendiendo el procedimiento poner en contacto el hidrato de carbono y el componente de unión con 25 nanopartículas según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que los ligandos unidos a las nanopartículas comprenden un grupo hidrato de carbono que puede interrumpir la interacción del hidrato de carbono y el componente de unión.

52. Un procedimiento ex vivo de cribado de sustancias que pueden unirse a un ligando, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto las nanopartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 con uno o 30 más compuestos candidatos y (b) determinar si los compuestos candidatos se unen al ligando.

53. Un procedimiento de determinación de la presencia en una muestra de una sustancia que puede unirse a un ligando, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto la muestra con las nanopartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 de manera que la sustancia se una al ligando de las nanopartículas y (b) determinar si la unión tiene lugar. 35

54. El procedimiento de la reivindicación 53 que comprende además la etapa de establecer una correlación de la presencia o ausencia de unión con el diagnóstico de un estado de enfermedad asociado a la presencia de la sustancia.

55. El procedimiento de la reivindicación 53 o la reivindicación 54, en el que la sustancia es un anticuerpo que puede unirse al ligando. 40

56. Un procedimiento ex vivo de determinación de si se produce o no una interacción mediada por hidrato de carbono, comprendiendo el procedimiento (a) poner en contacto una o más especies que se sospecha interactúan mediante una interacción mediada por hidrato de carbono con las nanopartículas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 y (b) determinar si las nanopartículas modulan o no la interacción mediada por hidrato de carbono. 45

57. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 56, en el que las nanopartículas se detectan por resonancia magnética nuclear (RMN), agregación, microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de fuerza atómica (AFM), resonancia de plasmones superficiales (SPR) o con nanopartículas que comprenden átomos de plata, amplificación de señales usando la reducción de plata (I) promovida por nanopartículas. 50