Procedimiento de producción de una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla,

que comprende: (i) producir mediante transformación plantas transgénicas de algodón que presentan una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC &916;12-desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón; y (ii) cultivar dichas plantas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la expresión del gen endógeno de oleil-PC &916;12-desaturasa correspondiente se reduzca en la semilla en virtud de la presencia de dicha secuencia nucleotídica en su genoma, (iii) seleccionar una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada

DATOS DE LA SOLICITUD RELACIONADA

Esta solicitud reivindica prioridad de la USSN 60/198.124 presentada el 18 de abril de 2000.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a un nuevo procedimiento de modificación de la composición del ácido graso de los aceites de semilla de algodón para mejorar sus características nutritivas y funcionales y a las plantas, partes de la planta y a los metabolitos producidos a partir de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La semilla del algodón es un producto valioso del algodón. La semilla del algodón contiene aproximadamente 25% de aceite de semilla de algodón, un aceite vegetal artículo de consumo muy conocido debido a su utilización como ingrediente alimenticio o como aceite para cocinar para la preparación de alimentos (Cherry, 1984). La producción mundial de aceite de semilla de algodón en 1997/98 fue de aproximadamente 4 millones de toneladas, siendo sexta en importancia detrás de los aceites de soja, aceite de palma, colza, girasol y cacahuete (Oil World Annual, 1998).

Globalmente, los cultivos de algodón constan de 4 especies de Gossypium spp. cultivadas, incluyendo las alotetraploides G. barbadense L. y G. hirsutum L. y las especies diploides G.arboreum L. y G. herbaceum L.. De estas cuatro especies, G. hirsutum (algodón de tierra alta) es la especie predominante, totalizando la aplastante mayoría de la producción de algodón en todo el mundo. Actualmente, la mayoría del aceite de semilla de algodón procede de G. hirsutum, posiblemente como consecuencia del hecho de que esta especie es la mayor fuente de fibra de algodón de todo el mundo y, las cosechas de algodón se cultivan principalmente por su fibra.

Los componentes principales del aceite de algodón son los ácidos grasos saturados, ácido palmítico (C16:0) y ácido esteárico (C18:0); el ácido graso monoinsaturado, ácido oleico (C18:1); y los ácidos grasos poliinsaturados, ácido linoleico (C18:2) y ácido α-linolénico (C18:3). Un perfil de ácido graso de semillas de algodón típico contiene grandes niveles de ácido palmítico (24%) y de ácido linoleico (54%), un nivel moderada de ácido oleico (18%) y muy bajo nivel de ácido esteárico (3%) y de ácido αlinolénico (1%).

El número, posición y configuración de un doble enlace en cada ácido graso presente en las semillas de algodón, influye en las propiedades físicas (tal como la temperatura de fusión), propiedades químicas y valor nutritivo del aceite de semilla de maíz, y las aplicaciones en las que puede introducirse, particularmente en la industria alimentaria.

Por ejemplo, la presencia de un doble enlace de carbono en un ácido graso monoinsaturado o un ácido graso poliinsaturado reduce su temperatura de fusión, en comparación con la temperatura de fusión de un ácido graso saturado de la misma longitud de la cadena de carbono, de modo que los ácidos grasos insaturados C-18, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico, son todos líquidos a temperatura ambiente.

Además, la sensibilidad de un ácido graso a la oxidación aumenta proporcionalmente con el número de doble enlaces de carbono presentes en la molécula de ácido graso, reduciendo drásticamente la idoneidad de los aceites que contienen ácidos grasos poliinsaturados a las aplicaciones que conllevan la utilización de calor prolongado en presencia de oxígeno, tal como cocinado y otras aplicaciones de servicio alimentario.

Para las aplicaciones que requieren componentes de grasa sólidos, tales como en las grasas para cocinar sólidas, mantequilla o margarinas, es necesario tener niveles moderadamente altos de ácidos grasos saturados, o los ácidos grasos trans funcionalmente equivalentes. Los ácidos grasos trans tienen enlaces dobles de carbono en orientación trans en lugar de en orientación cis natural.

Actualmente, los ácidos grasos insaturados se someten a hidrogenación química, para mejorar su idoneidad en aplicaciones de cocinado y servicio alimentario. El aceite de semilla de algodón hidrogenado es un producto valioso, porque el aceite de semilla de algodón tiene un nivel elevado natural de ácido palmítico, y pueden conseguirse fácilmente propiedades de fusión deseadas por el procedimiento de hidrogenación. En este procedimiento los ácidos grasos trans se producen como un artefacto.

La calidad nutritiva del aceite de semilla de algodón natural, y del aceite de semilla de algodón hidrogenado ha sido cuestionada debido a los efectos desfavorables publicados tanto de los ácidos grasos saturados como de los ácidos grasos trans (Wollett, 1994). La contribución de altos niveles de algunos ácidos grasos saturados en la dieta, particularmente ácido palmítico, en el aumento de colesterol en la sangre, y más particularmente en el aumento de lipoproteína de baja densidad (LDL), está bien demostrada. La LDL elevada en la sangre se ha asociado con un aumento de riesgo de enfermedad cardiovascular en la especie humana. Además, los ácidos grasos trans también elevan el colesterol LDL de manera similar al ácido palmítico. Debido a la asociación probada con riesgo de enfermedad cardiovascular, los nutricionistas y las autoridades sanitarias recomendaron generalmente limitar la ingesta alimenticia de ácido palmítico, y los ácidos grasos trans, a por lo menos inferior al 30% de la ingesta total de grasas. Los aceites naturales ricos en ácido palmítico y los aceites hidrogenados ricos en ácidos grasos trans, es de esperar que pierdan aceptación como consecuencia de estas recomendaciones.

Sin embargo, no todos los ácidos grasos saturados están asociados a un colesterol elevado. Por ejemplo, se ha publicado que el ácido esteárico tiene efectos neutros sobre el colesterol de la sangre (Wollett, 1994). A éste respecto, la alta temperatura de fusión del ácido esteárico (aproximadamente 70ºC) lo convierte asimismo en particularmente adecuado en aplicaciones de grasa sólida. Por consiguiente, debido a sus efectos neutrales sobre los niveles de colesterol en sangre, un aceite que contiene ácido esteárico elevado es un sustituto deseable de los aceites vegetales parcialmente hidrogenados utilizados actualmente en la producción de margarina. Debido a sus propiedades fisicoquímicas, el ácido esteárico es también adecuado para su utilización en la producción de cosméticos, productos farmacéuticos y velas (Topfer, 1995). Además, el nuevo aceite de semilla de algodón con proporciones aproximadamente iguales de palmítico, esteárico y oleico y por consiguiente con considerable potencial para su utilización como sustituto de la manteca de cacao.

Aunque los ácidos grasos poliinsaturados son beneficiosos desde el punto de vista del metabolismo de las lipoproteínas y de la salud cardiovascular, son muy sensibles a la peroxidación.

En resumen, debido a que la utilización principal del aceite de semilla de algodón es como artículo alimenticio, hay necesidad de desarrollar aceites mejorados que tengan valor nutritivo humano aumentado, tal como, por ejemplo, los aceites que han el ácido palmítico y/o son ricos en ácido esteárico. Además, existe también necesidad de mejorar las aplicaciones potenciales del aceite de semilla de algodón en la industria alimentaria, sin los desfavorables riesgos sanitarios asociados a la utilización de aceites ricos en muchos ácidos grasos saturados, proporcionando aceites con nuevas características de ácido graso insaturado. Por ejemplo, los aceites que tienen alto contenido en ácido oleico y/o bajo contenido en ácido linolénico tienen las propiedades fisicoquímicas deseadas de un aceite para cocinar y no requieren hidrogenación (Kinney, 1996).

Además, el triacilglicerol compuesto por aproximadamente proporciones iguales de ácido palmítico, ácido oleico y ácido esteárico (es decir, triacilglicerol tipo POS) tiene un punto de fusión muy definido alrededor de la temperatura corporal, haciéndole particularmente adecuado como sustituto de la manteca de cacao en la preparación de chocolate y de otros dulces (Fincke, 1976; Gunstone et al.,1986). Actualmente, las semillas del árbol del cacao, Theobroma cacao L., es la única fuente de manteca de cacao, y, en consecuencia, la manteca de cacao está con frecuencia falta de suministro y es costosa. El desarrollo de sustitutos de la manteca de cacao es de considerable importancia económica.

En algunos casos, los cultivadores de la planta han sido capaces de modificar el contenido o la composición del ácido graso de los aceites derivados de la semilla, incluyendo mutaciones en los...

Reivindicaciones

1. Procedimiento de producción de una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla, que comprende:

(i) producir mediante transformación plantas transgénicas de algodón que presentan una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón; y

(ii) cultivar dichas plantas durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa correspondiente se reduzca en la semilla en virtud de la presencia de dicha secuencia nucleotídica en su genoma,

(iii) seleccionar una planta de algodón transgénica que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el aceite de semilla de la planta de algodón transgénica presenta un nivel reducido de ácido palmítico que comprende una reducción de 25% en el contenido de ácido palmítico en comparación con el aceite de semilla de plantas de algodón Coker no transformadas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el nivel de ácido palmítico en el aceite de semilla se reduce a aproximadamente 50% del nivel de ácido palmítico en el aceite de semilla de plantas de algodón no transformadas.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia nucleotídica se selecciona de entre el grupo constituido por:

(i) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 7 o en un fragmento de la misma;

(ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 4 o en un fragmento de la misma;

(iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

(iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y constituida por una secuencia nucleotídica seleccionado de entre el grupo constituido por:

(a) la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii);

y

(b) la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la construcción génica comprende la región de codificación de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o en un fragmento de la misma en la orientación antisentido.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la construcción génica comprende una secuencia de repetición invertida del extremo terminal en 5' de la SEC. ID. nº: 3 que presenta autocomplementariedad o una repetición invertida de la construcción 5' no traducida del gen ghFAD2-1 expuesto en la SEC. ID. nº: 7 que presenta autocomplementariedad.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además transformar la planta de algodón transgénica o una célula de dicha planta con una segunda construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de Δ9-estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo dispuesta operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen

o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón durante un tiempo y en condiciones suficientes para disminuir la expresión del gen endógeno de Δ9-estearoil-ACP desaturasa correspondiente en la semilla de dicha plante de algodón.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que la segunda construcción génica comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 1 o un fragmento de la misma;

(ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 2 o un fragmento de la misma;

(iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

(iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y que está constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii); y

(b) la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la construcción génica comprende la región de codificación de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 1 o en un fragmento de la misma en la orientación antisentido.

10. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la construcción génica comprende una secuencia de repetición invertida del extremo terminal en 5' de la SEC. ID. nº: 1 que presenta autocomplementariedad.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que la repetición invertida está interrumpida por una secuencia interviniente.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la secuencia interviniente es una secuencia de intrón.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el intrón escindible es el primer intrón del gen ghFAD2-1.

14. Procedimiento de modificación del aceite endógeno de una planta de algodón que comprende:

(i) transformar o transfectar una célula, tejido u órgano de la planta de algodón con una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de Δ9 estearoil-ACP desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y regenerar una planta de algodón a partir de dicha célula, tejido u órgano vegetal, en el que la expresión del gen endógeno de Δ9 estearoil-ACP desaturasa en la semilla de dicha planta se reduce cuando dicha planta se cultiva durante un tiempo y en condiciones suficientes por lo tanto;

(ii) transformar o transfectar una célula, tejido u órgano de la planta de algodón con una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o un fragmento génico del mismo operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de una planta de algodón, y regenerar una planta de algodón a partir de dicha célula, tejido u órgano vegetal, en el que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa en la semilla de dicha planta se reduce cuando dicha planta se cultiva durante un tiempo y en condiciones suficientes por lo tanto;

(iii) cruzar la planta de algodón de (i) o una planta de algodón constituida por una descendencia de la planta de (i) en el que dicha descendencia comprende dicha secuencia nucleotídica de un gen de Δ9 estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo, con la planta de algodón de (ii) o con una planta de algodón constituida por una descendencia de la planta de (ii) en el que dicha descendencia comprende dicha secuencia nucleotídica de un gen de oleoil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo; y

(iv) seleccionar la descendencia de dicho cruzamiento en el que dicha descendencia presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta de algodón isogénica no transformada.

15. Planta de algodón transgénica

(i) que comprende en su genoma una construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa, o un fragmento génico del mismo, operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de dicha planta de algodón; y

(ii) en la que la expresión del gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa correspondiente se reduce en la semilla en virtud de la presencia de dicha construcción génica en su genoma, y

(iii) que presenta un nivel reducido de ácido palmítico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

16. Planta de algodón según la reivindicación 15, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 7 o en un fragmento de la misma;

(ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 4 o en un fragmento de la misma;

(iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

(iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a) la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii); y

(b) la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

17. Planta de algodón constituida por una descendencia de la planta según la reivindicación 15, en la que dicha descendencia presenta el nivel de ácido palmítico disminuido en la semilla y comprende dicha construcción génica.

18. Planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que comprende además en su genoma una segunda construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica de un gen de Δ9-estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo, operativamente en conexión con una secuencia promotora que puede proporcionar la expresión de dicho gen o fragmento génico en la semilla de dicha planta de algodón, y que presenta un nivel aumentado de ácido esteárico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

19. Planta de algodón según la reivindicación 18, en la que dicha segunda construcción génica comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 1 o un fragmento de la misma;

(ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 2 o un fragmento de la misma;

(iii) una secuencia nucleotídica que es complementaria de (i) o (ii); y

(iv) una secuencia de repetición invertida que presenta autocomplementariedad y constituida por una secuencia nucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por:

20. Planta de algodón constituida por descendencia de la planta según la reivindicación 18 ó 19, en la que dicha descendencia presenta el nivel disminuido de ácido palmítico y el nivel aumentado de ácido esteárico en la semilla, y en la que dicha descendencia comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo, y dicha segunda construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de Δ9estearoil-ACP desaturasa o fragmento génico del mismo.

21. Planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 y que presenta además un nivel disminuido de ácido linoleico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

22. Planta de algodón constituida por una descendencia de la planta según la reivindicación 21, en la que dicha descendencia presenta además un nivel disminuido de ácido linoleico en la semilla y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo.

23. Semilla de la planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, en la que dicha semilla presenta el nivel disminuido de ácido palmítico y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo.

24. Semilla según la reivindicación 23, en la que dicha semilla presenta además un nivel aumentado de ácido esteárico.

25. Semilla de la planta según la reivindicación 23, en la que dicha semilla presenta además un nivel disminuido de ácido linoleico.

26. Utilización de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 o de una semilla según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 para producir aceite de semilla de algodón, en la que dicho aceite presenta un contenido en ácido palmítico reducido que comprende una reducción de 25% en ácido palmítico en comparación con el aceite de semilla de plantas de algodón Coker no transformadas.

27. Utilización según la reivindicación 26, en la que dicho aceite presenta una característica adicional seleccionada de entre el grupo constituido por:

(i) un alto contenido en ácido oleico;

(ii) un alto contenido en ácido esteárico;

(iii) un alto contenido en ácido esteárico y un alto contenido en ácido oleico; y

(iv) un contenido reducido en ácido linoleico.

28. Utilización según la reivindicación 26 ó 27, en la que dicho aceite comprende 80% de ácido oleico.

29. Utilización según la reivindicación 27, en la que dicho aceite presenta un contenido reducido en ácido linoleico que representa más de un 50% de reducción en el contenido de ácido linoleico en comparación con el aceite de semilla de plantas de algodón Coker no transformadas.

30. Utilización según la reivindicación 27, en la que los ácidos grasos totales del aceite comprenden 10 a 31% de ácido linoleico.

31. Construcción génica para reducir el contenido en ácido palmítico del aceite de semilla de algodón, que comprende la secuencia con repetición invertida que presenta autocomplementariedad, dispuesta operativamente en conexión con una secuencia promotora que es operable en semillas de algodón, en el que dicha secuencia con repetición invertida comprende:

(i) la secuencia nucleotídica expuesta en la SEC. ID. nº: 3 o la SEC. ID. nº: 7 o un fragmento de la misma; o

(ii) una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC. ID. nº: 4 o un fragmento de la misma, (a) la secuencia nucleotídica de (i) unida a la secuencia nucleotídica de (iii); y (b) la secuencia nucleotídica de (ii) unida a la secuencia nucleotídica de (iii).

unida a una secuencia nucleotídica que es complementaria de las mismas.

32. Construcción génica según la reivindicación 31, en la que la secuencia con repetición invertida se selecciona de entre el grupo constituido por:

(i) el extremo del terminal 5' de la SEC. ID. nº: 3 que presenta autocomplementariedad; y

(ii) la región no traducida en 5' del gen ghFAD2-1 expuesto en la SEC. ID. nº: 7 que presenta autocomplementariedad.

33. Construcción génica según la reivindicación 31 ó 32, en la que la secuencia promotora es una secuencia promotora del gen de lectina de soja del promotor del gen ghFAD2-1.

34. Planta de algodón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22 y que presenta además un nivel aumentado de ácido oleico en la semilla en comparación con una planta isogénica no transformada.

35. Planta de algodón constituida por una descendencia de la planta según la reivindicación 34, en la que dicha descendencia presenta además un nivel aumentado de ácido oleico en la semilla y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12-desaturasa o fragmento génico del mismo.

36. Semilla según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en la que dicha semilla presenta además un nivel aumentado de ácido oleico y comprende dicha construcción génica que comprende la secuencia nucleotídica de un gen de oleil-PC Δ12

37. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho gen endógeno de oleil-PC Δ12-desaturasa es un gen de ghFAD2-1.