MICROSCOPIO ÓPTICO CAPAZ DE OPERAR UNA MODULACIÓN TRIDIMENSIONAL RÁPIDA DE LA POSICIÓN DEL PUNTO DE OBSERVACIÓN.

Microscopio óptico capaz de operar una modulación tridimensional rápida de la posición del punto de observación La presente invención se refiere a un microscopio óptico para la observación de una muestra, tanto a través de un ocular como para su uso en una configuración confocal, según se define en el preámbulo de la reivindicación 1. En la observación de una muestra, por ejemplo para investigación en el campo de la biología celular, en el que es necesario ser capaz de enfocar la imagen sobre diferentes planos de observación y/o rastrear una partícula o una célula durante su movimiento libre por el entorno circundante, es necesario disponer de instrumentos ópticos para la formación de imágenes que permitan una exploración tridimensional rápida y precisa del campo de visión. En los microscopios dispuestos para rastrear una partícula, el sistema óptico del microscopio debe ser capaz de mantener la partícula enfocada mientras sigue su movimiento completo. La consecución de estos objetivos utilizando técnicas de exploración cónica de un plano de observación, junto con técnicas tradicionales de autoenfoque para las que el movimiento de la unidad de objetivo del microscopio o de la platina de la muestra tiene lugar a lo largo del eje óptico, según se describe por ejemplo en los documentos US 5483055 y US 4000417, no permite que se efectúe el rastreo tridimensional mediante ajuste de los medios de enfoque en tiempos más cortos de entre 20 ms y 1 s, debido a la inercia de la unidad de objetivo o de la platina de la muestra. Esto se aplica tanto a los microscopios convencionales para la visión directa por parte de un operario a través de un sistema de ocular, como a microscopios confocales, en los que la exploración de una abertura confocal conjugada respecto a un punto de observación permite la formación de una imagen punto a punto, con mejores contraste y resolución. En la técnica anterior se puede obtener también la observación con rastreo tridimensional de una partícula mediante la construcción de la imagen volumétrica de la muestra por superposición de imágenes detectadas a través de una exploración de dos dimensiones de una sucesión de planos focales de observación. La exploración axial tiene lugar moviendo el objetivo del microscopio por medio de un actuador, y un dispositivo de cálculo determina la posición de la partícula bajo observación después de haber adquirido varias imágenes en planos diferentes. Soluciones técnicas de este tipo se encuentran descritas en el documento US 5932872 y en el artículo 3D Particle Tracking on the Two- Photon Microscope de di T. Ragan, P.T. So, H. Kwon y E. Gratton, que apareció en los procedimientos de SPIE, vol. 4262, durante 2001. El documento DE 19733193 describe un microscopio con un sistema óptico adaptativo en la trayectoria del haz de observación y/o iluminación, con lo que un modulador de frente de onda basado en un elemento óptico reflectante, tal como un espejo deformable, está conectado a través de seccionadores de haz de modo que influye en la fase y/o la amplitud de una onda luminosa de tal modo que se consigue un desplazamiento y una conformación del foco en el espacio objeto sin ninguna influencia mecánica del objetivo o de la platina de la muestra. El objeto de la presente invención consiste en proporcionar un microscopio óptico para la observación sobre una superficie arbitraria, y el rastreo tridimensional, de partículas, que permite una modulación rápida de la posición del foco a lo largo de una dirección paralela al eje óptico, junto con una exploración en un plano de observación ortogonal a este eje, evitando las desventajas de la técnica anterior. De acuerdo con la presente invención, este objeto ha sido conseguido por medio de un microscopio óptico que tiene las características que aparecen expuestas en la reivindicación 1. Realizaciones particulares de la invención han sido definidas en las reivindicaciones dependientes. En resumen, la presente invención se basa en el principio de modificar la trayectoria óptica de un haz de luz recogido por el objetivo y dirigido hacia un plano de imagen real (en un microscopio confocal), o una dirección de observación (para un microscopio tradicional) introduciendo, aguas abajo del objetivo, un sistema óptico adicional que hace que sea posible modular el plano focal del instrumento sin intervenir en el movimiento de la unidad de objetivo o de la platina portadora de la muestra. Este sistema forma una trayectoria óptica suplementaria que comprende, en la realización preferida, una lente y un espejo dispuestos cerca del foco de la lente, cuya separación mutua a lo largo del eje óptico del sistema puede ser modificada de tal modo que varíe el plano de observación de la muestra enfocada sobre el plano de imagen. En una definición óptica general que adoptaremos en la descripción que sigue, un sistema que incluye tanto superficies de refracción como superficies de reflexión, será denominado como un sistema catadióptrico. En una realización alternativa, la trayectoria óptica suplementaria comprende solamente espejos, y en este caso 2 ES 2 365 848 T3 adoptaremos por conveniencia la denominación de sistema catóptrico. Una variante de la trayectoria suplementaria, aplicable tanto a los sistemas catadióptricos como al sistema catóptrico, proporciona la interposición de un par de prismas giratorios entre los elementos del sistema, los cuales se mantienen de ese modo fijos. Ventajosamente, la arquitectura del microscopio conforme a la invención permite que éste sea formado como un microscopio tradicional para el rastreo de partículas libres por medio de exploración cónica en tres ejes, mejorando el sistema conocido de exploración cónica sobre dos ejes, así como un microscopio confocal para la detección de imágenes sobre una superficie de observación arbitraria y posible rastreo mediante exploración cónica tridimensional. Otras características y ventajas de la invención serán explicadas con mayor detalle en la descripción detallada que sigue, dada a título de ejemplo no limitativo, con referencia a los dibujos anexos, en los que: la figura 1 es una representación esquemática de una realización preferida del sistema óptico completo de un microscopio conforme a la invención; la figura 2 es una representación esquemática de una porción del sistema óptico ilustrado en la figura 1, de acuerdo con una variante de realización; y la figura 3 es una representación esquemática de una porción del sistema óptico ilustrado, según una realización alternativa. En la ilustración esquemática de la figura 1, un objeto, o de manera más general una muestra bajo observación, ha sido indicada con 10, iluminada por ejemplo mediante radiación luminosa procedente de una fuente exterior al microscopio, y capaz de difundir la radiación luminosa incidente o la propia radiación de emisión mediante fluorescencia. El sistema óptico del microscopio comprende un objetivo 20, identificado simbólicamente en este caso como una simple lente, dispuesto cerca de la muestra 10 para recoger la luz difundida por, o emitida desde, el mismo, y para formar un haz de luz colimada o enfocada. La trayectoria óptica del instrumento en su sección inicial comprende una serie de espejos fijos 22, 24, 26 para desviar el haz de luz, utilizados para replegar el haz a los efectos de reducir el tamaño del instrumento, y una lente de campo 27 para la determinación del campo de visión de la imagen del objeto bajo observación. Un espejo móvil, indicado con 28, es susceptible de inclinación en torno a dos ejes ortogonales por medio de un posicionador piezoeléctrico, y es operable para producir una desviación angular del haz. Esta función puede ser realizada de una manera similar por medio de un par de espejos móviles, cada uno de ellos inclinable en torno a un solo eje, o mediante una lente móvil. Un sistema óptico 30 adicional, operable para modular la posición del área de observación de muestra a lo largo del eje óptico, está interpuesto en la trayectoria óptica de un modo tal como para introducir una ramificación suplementaria de la trayectoria luminosa. Un divisor 32 de haz (por ejemplo, un espejo dicroico), se encuentra interpuesto a lo largo de la trayectoria óptica, aguas abajo del sistema 30 para dirigir una porción del haz hacia una lente 34 de recogida (ocular), que permite dirigir la visión a través del instrumento por parte de un operario, y que permite la transmisión de una porción de haz incidente sobre una abertura 36 confocal conjugada con respecto al área de observación, por detrás de la cual se encuentra situado un fotodetector 38 alineado con el eje óptico del sistema, y operable para detectar la intensidad luminosa instantánea del haz. El sistema óptico 30 adicional incluye un divisor de haz, por ejemplo... [Seguir leyendo]

1.- Un microscopio óptico para la observación de una muestra (10) capaz de difundir o emitir un haz de rayos luminosos, que incluye un sistema óptico principal para la formación de una imagen real o virtual de un área de observación de la muestra (10), que comprende: una trayectoria óptica principal desde un objetivo (20) hacia un plano de imagen real o, respectivamente, hacia la dirección de observación de una imagen virtual, y un sistema óptico (30) adicional, interpuesto a lo largo de la citada trayectoria óptica, operable para modular la posición del área de observación de la muestra (10) a lo largo del eje óptico, cuya imagen se forma o se observa en el foco, incluyendo el citado sistema: - medios ópticos (40) de divisor de haz operables para desviar el citado haz desde la trayectoria óptica principal hacia una ramificación suplementaria de la trayectoria, y - un sistema óptico (44, 46; 55, 57) de configuración variable operable para modular la longitud de la trayectoria suplementaria; siendo los citados medios de divisor (40) operables para reintroducir el haz que emerge desde el citado sistema (44, 46; 55, 57) de configuración variable, en la citada trayectoria principal hacia el plano de imagen real o, respectivamente, hacia la dirección de observación de la imagen virtual, en el que el microscopio incluye medios de actuador operables para mover el citado sistema (44, 46; 55, 57) de configuración variable de una manera predeterminada, que se caracteriza porque los medios móviles (28) de divisor de haz están interpuestos a lo largo de la trayectoria óptica principal, los cuales son operables para dirigir imágenes de un área seleccionada del plano de observación de la muestra (10) hacia el citado plano de imagen real o en la citada dirección de observación, y porque el citado sistema de configuración variable para modular la posición de la citada área de observación de la muestra (10) a lo largo del eje óptico, comprende una lente (44) convergente o un espejo (55) convergente, y un espejo (46, 57) posicionado cerca del foco de dicha lente (44) convergente o de dicho espejo (55) convergente, y perpendicularmente al eje óptico. 2.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque incluye medios fotodetectores (38) dispuestos cerca del plano de imagen real del sistema óptico principal, y alineados con el eje óptico del sistema, para la detección instantánea de la intensidad luminosa del haz, y porque lo citados medios de actuador están dispuestos para regular la orientación de los citados medios desviadores (28) de haz, y para variar la configuración espacial del sistema (44, 46; 55, 57) de configuración variable en un primer modo operativo, de tal manera que provocan un desplazamiento alternativo del área y del plano de observación en torno al punto de observación, consiguiendo de ese modo una exploración en tres dimensiones. 3.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 2, que se caracteriza porque los medios de actuador están dispuestos además para regular la orientación de dichos medios desviadores (28) de haz, y para variar la configuración espacial del sistema (44, 46; 55, 57) de configuración variable en un segundo modo operativo, de tal manera que realiza un desplazamiento corrector del área y del plano de observación en función de la señal emitida por los citados medios fotodetectores (38), para realizar un rastreo en tres dimensiones de un objeto bajo observación. 4.- Un microscopio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque incluye una abertura (36) confocal, conjugada con un punto de observación, operable para permitir una transmisión de una porción del haz luminoso hacia medios fotodetectores (38) dispuestos aguas abajo de la citada abertura (36) y alineados con el eje óptico del sistema, y porque los medios de actuador están dispuestos de modo que regulan la orientación de los citados medios desviadores (28) de haz, y para variar la configuración espacial del sistema (44, 46; 55, 57) de configuración variable en un tercer modo operativo, de tal manera que provocan un desplazamiento en tres dimensiones del punto de observación en una trayectoria de observación predeterminada; siendo las imágenes de una pluralidad de puntos de observación, recogidas por los citados medios fotodetectores (38), transmitidas a medios de procesador asociados para la reconstrucción de una imagen completa. 5.- Un microscopio de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que se caracteriza porque el citado sistema de configuración variable es un sistema catadióptrico que comprende una lente (44) y un espejo (46) convergentes. 6.- Un microscopio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza porque el citado sistema de configuración variable es un sistema catóptrico que comprende un primer espejo (55) convergente y un segundo espejo (57) plano. 6 ES 2 365 848 T3 7.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que se caracteriza porque los citados medios desviadores de haz comprenden un prisma de polarización (40). 8.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que se caracteriza porque los citados medios de divisor de haz comprenden un espejo dicroico. 9.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que se caracteriza porque los citados medios de divisor de haz comprenden un espejo parcialmente reflectante. 10.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que se caracteriza porque el citado sistema óptico (30) adicional comprende además una placa (42) de cuarto de onda, interpuesta entre los citados medios (40) de divisor de haz y el citado sistema (44, 46; 55, 57) de configuración variable, operable para realizar una conversión de la polarización del haz incidente. 11.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 5, que se caracteriza porque los citados medios de actuador son operables para variar la distancia relativa entre la lente (44) y el espejo (46). 12.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 11, que se caracteriza porque los citados medios de actuador comprenden un posicionador magnético o piezoeléctrico, operable para provocar la traslación de la lente (44) a lo largo del eje óptico. 13.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 11, que se caracteriza porque los citados medios de actuador comprenden un posicionador magnético o piezoeléctrico, operable para provocar la traslación del espejo (46) a lo largo del eje óptico. 14.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza porque los citados medios de actuador comprenden un posicionador magnético o piezoeléctrico, operable para provocar la traslación del espejo plano (57) a lo largo del eje óptico, con el fin de variar la distancia del mismo respecto al espejo (55) convergente. 15.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 5, que se caracteriza porque el sistema catadióptrico comprende un par de prismas (48) giratorios, interpuestos entre la lente (44) y el espejo (46). 16.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza porque el sistema catóptrico comprende un par de prismas (48) giratorios, interpuestos entre el espejo (55) convergente y el espejo (57) plano. 17.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 15 o la reivindicación 16, que se caracteriza porque los citados medios de actuador están dispuestos para comandar la rotación del citado par de prismas (48) en virtud de la cual se cambia la longitud de la ramificación suplementaria de la trayectoria óptica. 18.- Un microscopio de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que dicho desviador de haz móvil comprende un espejo móvil (28) capaz de girar en torno a dos ejes ortogonales. 19.- Un microscopio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que los citados medios desviadores de haz incluyen un par de espejos móviles independientes capaces de girar en torno a ejes ortogonales respectivos. 20.- Un microscopio de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en el que cada espejo móvil se mueve mediante un posicionador piezoeléctrico o magnético respectivo. 21.- Un microscopio de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que incluye un sistema óptico ocular (32, 34) para la observación por parte de un operario. 22.- Un microscopio de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que incluye medios para la iluminación coaxial de la muestra, los cuales incluyen una fuente de iluminación y medios (50) de divisor de haz en la trayectoria óptica y capaces de recibir un haz de luz procedente de la fuente, siendo los citados medios (50) de divisor de haz operables para reflejar el haz de luz, a lo largo del eje óptico del sistema hacia el objetivo (20), y para permitir la transmisión hacia el plano de imagen real o, respectivamente, en la dirección de observación del haz de luz recogido por el objetivo (20). 23.- Un microscopio de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que incluye un elemento reflectante (52) susceptible de ser insertado entre el objetivo (20) y los citados medios desviadores (28) de haz, para acoplar el microscopio a una óptica externa de formación de imágenes, y para la exclusión del haz recogido por el objetivo (20). 7 ES 2 365 848 T3 8 ES 2 365 848 T3 9