Método de detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular.

La presente invención trata de un método de detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular comprendiendo las siguientes etapas:- adquirir una secuencia de imágenes bidimensionales de una sección determinada de una o más células, incluyendo información relativa a actividad de calcio intracelular;- normalizar dichas imágenes;- realizar un análisis estadístico de la distribución espacio-temporal de píxeles en dicha secuencia de imágenes normalizadas, para determinar unas regiones de interés, y determinar que dichas regiones de interés son candidatas a contener un evento local de liberación de calcio intracelular de interés; y.- realizar las siguientes etapas, automáticamente y de manera previa a dicho análisis estadístico:- detectar eventos globales de liberación de calcio en una o más de las imágenes de dicha sucesión de imágenes; y- realizar dicho análisis estadístico solamente sobre las imágenes en las cuales no se han detectado eventos globales de liberación de calcio

Método de detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular.

Sector de la técnica

La presente invención concierne en general a un método de detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular, que comprende realizar un análisis estadístico de la distribución espacio-temporal de píxeles en una secuencia de imágenes de una sección de una célula, y en particular a un método que comprende realizar una preselección automática de las imágenes sobre las que realizar dicho análisis estadístico para evitar la posible influencia distorsionadora que puedan tener unos eventos globales de liberación de calcio.

Estado de la técnica anterior

Son conocidas diversas propuestas relativas a la detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular, en particular para detectar espículas de calcio. En general se utilizan marcadores fluorescentes en combinación con técnicas de microscopía láser confocal para detectar las espículas de calcio, aunque otras técnicas, tal como la utilización de cámaras CCD, también son conocidas.

La mayoría de dichas propuestas se hallan descritas en artículos especializados, algunos de los cuales serán citados a continuación, y descritos brevemente, por considerarse como representativos del estado de la técnica más cercano a la presente invención.

Uno de dichos artículos es el de J. I. Goldhaber et al., "Local regulation of the threshold for calcium sparks in rat ventricular myocytes: role of sodium-calcium exchange", publicado en "Journal of Physiology (1999), 520.2, pp. 431-438", donde se describe un procedimiento para detectar espículas de calcio a partir de unas imágenes bidimensionales, no directamente adquiridas de manera simultánea, sino construidas a partir de un conjunto de líneas escaneadas mediante un microscopio láser confocal. En su Fig. 2 puede verse un ejemplo donde las imágenes de fluorescencia A y C han sido construidas a partir de un barrido lineal de 320 ms de duración mediante un microscopio confocal. En las vistas B y C se muestran, en un marco espacio-temporal, sendas imágenes correspondientes, cada una de ellas, a la información obtenida en una sola línea escaneada. Puede observarse cómo el número de espículas de calcio de cada una de las vistas B y D es muy inferior al de las vistas A y C. Si además se tiene en cuenta que, por ejemplo, el escaneado de la línea asociada a la vista B no volverá a producirse hasta pasados 320 ms, toda la información relativa a espículas de calcio que se produzca durante dicho periodo de tiempo en dicha línea no será obtenida. Todos estos inconvenientes provocan que se llegue a una subestimación del número y morfología de las espículas de calcio.

Con el fin de superar en cierta medida los inconvenientes que el escaneado lineal provoca a la hora de detectar espículas de calcio que no coinciden con el plano focal de ninguna de las líneas escaneadas, H. Cheng et al. han desarrollado una propuesta, plasmada en el artículo "Amplitude Distribution of Calcium Sparks in Confocal Images: Theory and Studies with an Automatic Detection Method" de "Biophysical Journal Volume 76 February 1999 606-617", mediante la cual parte de la información relativa a eventos de liberación de calcio que se han quedado fuera del plano focal de las líneas escaneadas, es decir que no han sido directamente escaneados, se recupera de manera indirecta al analizar la difusión que dichos eventos han provocado en zonas vecinas que sí han sido escaneadas. Dichas espículas son así detectadas de manera indirecta pero con una intensidad máxima atenuada, con el resultado de que la distribución de amplitud de las espículas detectadas es sesgada en función de la distancia a la que se encuentren respecto a la línea escaneada.

En el artículo de M. A. Bray et al., "Multidimensional Detection and Analysis of Ca Sparks in Cardiac Myocytes", incluido en "Biophysical Journal Volume 92 June 2007 4433-4443", se realiza una propuesta la cual se considera como el antecedente más cercano a la presente invención, que representa un paso más allá en la detección de espículas de calcio con respecto a las propuestas anteriores, ya que en lugar de analizar unas imágenes generadas a partir de la información adquirida mediante unas líneas escaneadas durante un barrido, se analizan secuencias de imágenes bidimensionales capturadas mediante microscopía confocal 2D o mediante una cámara CCD. Se describe en dicho artículo la utilización de técnicas estadísticas para analizar dichas imágenes una vez pre-procesadas o normalizadas. Para llevar a cabo dicha normalización toman en consideración tanto una fluorescencia basal detectada en la secuencia de imágenes como distintos eventos transitorios detectados.

Tras normalizar las imágenes, en dicho artículo se propone calcular un histograma de la distribución de píxeles en toda la secuencia de imágenes que denominan "histograma de intensidades", es decir cuantas veces un píxel ha tomado un cierto valor. Estiman que la mayoría de veces los píxeles tomarán unos valores que corresponden a actividad de ruido de fondo, lo cual es lógico ya que ésta es la actividad normal de la célula en reposo. Entonces proponen localizar el máximo del histograma y definir el valor umbral de píxel a partir del cual la actividad no es ruido sino un evento de liberación de calcio. Tras ello se propone definir unas regiones de interés como aquellas que incluyen píxeles que han superado un cierto número de veces el valor umbral definido, lo cual llevan a cabo mediante un parámetro supervisado, denominado Cri, que determina cuantas veces por encima del valor umbral debe encontrarse un píxel para considerar que la actividad corresponde a un evento de liberación de calcio.

Si bien la propuesta realizada por M. A. Bray et al. representa una clara mejora con respecto al estado de la técnica previo a la aparición de la misma, no obstante adolece de ciertos inconvenientes relacionados con el análisis estadístico realizado, y en particular con las influencias negativas que posibles eventos globales de liberación de calcio intracelular, detectados en algunas de las imágenes, pueden tener en el resultado final de dicho análisis, pudiendo llegar a distorsionar tanto los resultados obtenidos que provoquen que éstos no puedan considerarse como válidos. En particular dichos eventos globales de liberación de calcio intracelular distorsionarían el histograma de intensidades calculado hasta, posiblemente, llegar a invalidarlo.

Explicación de la invención

Obtener una detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular, en particular de espículas de calcio, que pueda considerarse fiable mediante un método suficientemente robusto, es algo de gran importancia, sobre todo en lo referente a la detección de dichos eventos en células cardíacas, o cardiomiocitos, teniendo en cuenta los últimos hallazgos que relacionan dichas espículas con patologías cardíacas.

Recientemente las arritmias auriculares y ventriculares se han asociado a alteraciones en la entrada de calcio a través de los canales de calcio, así como a la regulación del calcio intracelular producido por una hiperactividad del canal de calcio del retículo sarcoplasmático (también denominado receptor de rianodina o RYR2). Esta hiperactividad produce liberación espontánea de calcio del retículo sarcoplasmático. El exceso de calcio producido por dicha liberación espontánea se expulsa del citosol por el intercambiador Na-Ca (tres Na+ por un Ca2+), generándose así una despolarización anormal de la membrana, lo cual es una de las causas de la inducción y perpetuación de arritmias, ya que despolarizaciones anormales inducen arritmia por actividad repetitiva.

Actualmente, la liberación local de calcio denominada espícula de calcio, o "calcium spark", se considera el evento fundamental en la liberación de calcio del retículo sarcoplasmático. Se ha demostrado en cardiomiocitos de mamíferos que durante el potencial de acción se activan de manera sincronizada alrededor de diez mil espículas de calcio dando lugar a un transitorio de calcio ("calcium transient") y a una contracción normal. En situaciones patológicas, varias espículas de calcio pueden coincidir espacial y temporalmente durante la diástole, dando lugar a un aumento local del calcio intracelular suficientemente grande para desencadenar una liberación regenerativa de calcio del retículo sarcoplasmático que se extienda a través de la célula.

Por todo ello, y dado que las propuestas convencionales...

1. Método de detección de eventos locales de liberación de calcio intracelular, del tipo que comprende realizar las siguientes etapas:

- adquirir una secuencia de imágenes bidimensionales correspondientes a al menos parte de una sección determinada de al menos una célula, incluyendo información relativa a actividad de calcio intracelular;

- normalizar dichas imágenes; y

- realizar un análisis estadístico de la distribución espacio-temporal de píxeles en dicha secuencia de imágenes normalizadas, para determinar una serie de regiones de interés en dichas imágenes normalizadas, cada una de ellas común para toda la sucesión de imágenes, y determinar que dichas regiones de interés son candidatas a contener un evento local de liberación de calcio intracelular de interés;

estando dicho método caracterizado porque comprende, de manera previa a al menos dicho análisis estadístico, realizar las siguientes etapas, de manera automática:

- detectar eventos globales de liberación de calcio en al menos una de las imágenes de dicha sucesión de imágenes; y

- realizar dicho análisis estadístico solamente sobre las imágenes en las cuales no se han detectado eventos globales de liberación de calcio.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas imágenes bidimensionales adquiridas son unas imágenes de fluorescencia obtenidas mediante técnicas de microscopía confocal.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dichos eventos globales de liberación de calcio son liberaciones regenerativas globales de calcio del retículo sarcoplasmático de dicha célula, que es al menos una, que se propagan en forma de ondas globales.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de detección de eventos globales de liberación de calcio también de manera previa a dicha etapa de normalización, y porque comprende llevar a cabo dicha etapa de normalización solamente sobre las imágenes en las cuales no se han detectado eventos globales de liberación de calcio.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque comprende calcular al menos un índice de luminancia o fluorescencia base, a utilizar en dicha etapa de normalización, solamente con la información de las imágenes en las cuales no se han detectado eventos globales de liberación de calcio.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque comprende calcular la luminancia o fluorescencia media de cada píxel con las imágenes que no contienen eventos globales de liberación de calcio, y asignar el valor de dicha luminancia o fluorescencia media de cada píxel a un correspondiente índice de luminancia o fluorescencia base.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dicha etapa de normalización comprende normalizar cada píxel de dichas imágenes que no contienen eventos globales de liberación de calcio, utilizando su respectivo índice de luminancia o fluorescencia base calculado.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque comprende llevar a cabo dicha determinación de dichas regiones de interés mediante la realización de las siguientes etapas:

- detectar los píxeles cuya luminancia o fluorescencia ha tomado valores extremos en al menos una de las imágenes normalizadas, etiquetarlos como píxeles atípicos y contabilizar, de manera acumulativa en el tiempo, el número de veces que cada uno de dichos píxeles atípicos ha tomado un valor extremo o realizar la suma de los valores que han tomado los píxeles atípicos;

- normalizar dichos números de veces en que dichos píxeles atípicos han tomado valores extremos, de luminancia o fluorescencia, o los resultados de dicha suma, por píxel, en relación al número de veces promedio en el que los píxeles toman valores extremos en dicha secuencia de imágenes normalizadas y al número de imágenes normalizadas;

- seleccionar, de entre dichos píxeles atípicos con valores extremos, los que han tomado dichos valores extremos un número de veces, normalizado, por encima de un umbral predeterminado, o los que, en dicha suma, han obtenido un resultado, normalizado, por encima de un umbral determinado, y etiquetarlos como píxeles de interés; y

- definir al menos una de dichas regiones de interés uniendo al menos parte de los píxeles que superan dicho umbral predeterminado.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende definir varias de dichas regiones de interés uniendo los píxeles que superan dicho umbral predeterminado según una técnica estándar de conectividad de píxeles consistente en agrupar los píxeles que están en contacto a través de sus lados o de sus esquinas.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque comprende llevar a cabo dicha determinación de dichas regiones de interés mediante la realización de la siguiente etapa:

- calcular, para cada una de las imágenes normalizadas, la media y la desviación típica de los valores de luminancia o fluorescencia de sus píxeles.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque comprende llevar a cabo dicha determinación de dichas regiones de interés mediante la realización de la siguiente etapa:

- aplicar un filtro de mediana 2D a cada una de las imágenes normalizadas;

y porque comprende llevar a cabo dicha etapa de cálculo de la media y la desviación típica para cada una de las imágenes normalizadas, una vez filtradas.

12. Método según la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque comprende definir dichos valores extremos de luminancia o fluorescencia como aquellos que se encuentran por encima de dicha media calculada en más de un número predeterminado de veces multiplicado por dicha desviación típica calculada.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dichos eventos locales de liberación de calcio intracelular a detectar son espículas de calcio.

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque comprende llevar a cabo dicha detección de espículas de calcio mediante la clasificación de dichas regiones de interés en dos tipos en función de su tamaño:

- un primer tipo o grupo de regiones estándar, que incluye todas aquellas regiones de interés que tienen un tamaño similar o menor que el tamaño característico del soporte espacial donde se produce una espícula de calcio; y

- un segundo tipo o grupo de regiones agregadas, que incluye todas aquellas regiones de interés cuyo tamaño es mayor que el tamaño característico del soporte espacial donde se produce una espícula de calcio.

15. Método según la reivindicación 14, caracterizado porque comprende realizar las siguientes etapas para cada una de dichas regiones estándar:

- determinar la actividad promedio de la luminancia o fluorescencia en la región estándar, mediante el cálculo de la luminancia o fluorescencia en cada uno de los píxeles que forman parte de la región estándar y el cálculo de su promedio espacial a cada instante de tiempo;

- aplicar un método de detección por ondículas para detectar posibles espículas de calcio, localizando la posible actividad de las mismas en dicha área estándar; y

- rechazar dicha región estándar si su tamaño es inferior a un tamaño mínimo predeterminado o si no se ha detectado ninguna espícula de calcio en su interior como resultado de la aplicación de dicho método por ondículas; o

- establecer que dicha región estándar es una región definitiva de interés si su tamaño es superior a dicho tamaño mínimo predeterminado y sí se ha detectado al menos una espícula de calcio en su interior como resultado de la aplicación de dicho método por ondículas.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la realización de análisis posteriores, automáticos o mediante intervención humana, sobre dicha región estándar rechazada, si en la misma no se ha detectado al menos una espícula de calcio, con el fin de verificar si dicha falta de detección ha sido correcta.

17. Método según la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque comprende realizar las siguientes etapas para cada una de dichas regiones agregadas:

- subdividir dicha región agregada en sub-áreas adyacentes de un mismo, o sustancialmente un mismo, tamaño;

- determinar, para cada una de dichas sub-áreas agregadas la actividad promedio de la luminancia o fluorescencia en su interior, mediante el cálculo de la luminancia o fluorescencia en cada uno de los píxeles que forman parte de cada sub-área y el cálculo de su promedio espacial a cada instante de tiempo;

- aplicar un método de detección por ondículas para detectar posibles espículas de calcio, localizando la posible actividad de las mismas en cada una de dichas sub-áreas agregadas; y

- establecer que cada sub-área agregada en la que se ha detectado al menos una espícula de calcio en su interior como resultado de la aplicación de dicho método por ondículas, es una región definitiva de interés.

18. Método según la reivindicación 17, caracterizado porque comprende la realización de análisis posteriores, automáticos o mediante intervención humana, con la información de cada sub-área agregada en la que no se haya detectado ninguna espícula de calcio en su interior como resultado de la aplicación de dicho método por ondículas, con el fin de detectar características propias de posibles espículas de calcio localizadas en las cercanías de dicha sub-área agregada.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque dichos eventos locales de liberación de calcio intracelular a detectar son liberaciones regenerativas locales de calcio del retículo sarcoplasmático de dicha célula, que es al menos una, que se propagan en forma de mini ondas.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende detectar liberaciones regenerativas locales de calcio del retículo sarcoplasmático de dicha célula, que es al menos una, que se propagan en forma de mini ondas, en al menos una de las imágenes de dicha sucesión de imágenes; y realizar dicha o dichas etapas llevadas a cabo solamente sobre las imágenes en las cuales no se han detectado eventos globales de liberación de calcio, para llevarlas a cabo solamente sobre las imágenes en las cuales tampoco se han detectado mini ondas.

21. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho análisis estadístico es de tipo iterativo.

22. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende utilizar un sistema de microscopía confocal para realizar dicha adquisición de imágenes bidimensionales.

23. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque comprende utilizar un sistema con al menos una cámara CCD para realizar dicha adquisición de imágenes bidimensionales.

24. Método según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende ponderar dichos píxeles atípicos, y tener en cuenta el valor ponderado para llevar a cabo dicha selección y posterior etiquetado como píxeles de interés.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de adquisición de imágenes para adquirir una pluralidad de secuencias de unas imágenes bidimensionales correspondientes a unas secciones determinadas de una pluralidad de células.

26. Método según la reivindicación 1 ó 25, caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de adquisición de imágenes cuando dicha o dichas células están en reposo, con ausencia de estímulos externos.

27. Método según la reivindicación 1 ó 25, caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de adquisición de imágenes cuando dicha o dichas células están siendo, o han sido, sometidas a un estímulo eléctrico externo mediante una señal alterna.

28. Método según la reivindicación 27, caracterizado porque comprende variar la frecuencia de dicha señal de estímulo alterna durante dicha etapa de adquisición de imágenes.

29. Método según la reivindicación 1 ó 25, caracterizado porque comprende realizar dicha etapa de adquisición de dicha secuencia de imágenes cuando dicha o dichas células están en reposo, con ausencia de estímulos externos, y cuando están siendo sometidas a un estímulo eléctrico externo mediante una señal alterna, para adquirir una secuencia de imágenes que incluyen información relativa a actividad de calcio cuando al menos dicha célula no está siendo estimulada y cuando sí lo está siendo.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha o dichas células son al menos una del grupo que comprende los siguientes tipos de células: miocitos, cardiomiocitos y neuronas.