Un procedimiento para la producción de hormona del crecimiento,

que comprende la etapa de cultivar células de una línea celular que expresa hormona del crecimiento en un medio de cultivo celular exento de componentes derivados de suero animal, comprendiendo el medio zinc en una concentración que varía en el intervalo de 0,2 µM a 1,75 µM y cobre en una concentración que varía en el intervalo de 10 nM a 75 nM e iones férricos en una concentración de 5 ó 6 µM

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención es del campo del cultivo de células de mamíferos bajo condiciones de cultivo exentas de suero, en particular para el cultivo de células productoras de proteínas recombinantes como, por ejemplo, la hormona del crecimiento humano (hGH).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención usa un medio exento de suero para el crecimiento y mantenimiento de células de mamíferos en cultivo.

El cultivo de células es ampliamente usado en la actualidad para la preparación de diversos productos biológicamente activos como vacunas virales, anticuerpos monoclonales, inmuno-reguladores no anticuerpos, factores de crecimiento de polipéptidos, hormonas, enzimas, antígenos específicos para tumores, etc. Estos productos son preparados mediante células tratadas normales o transformadas y tratadas por ingeniería genética.

Para cultivar células, en el pasado, el medio de cultivo fue complementado con suero, que sirve como un nutriente universal para el crecimiento y mantenimiento de todas las líneas celulares de mamíferos que producen productos biológicamente activos. El suero contiene hormonas, factores de crecimiento, proteínas portadoras, factores de unión y extensión, nutrientes, elementos residuales, etc. Los medios de cultivo contenían habitualmente hasta aproximadamente 10% de suero de animal, como suero bovino fetal (FBS), también denominado suero de ternera fetal (FCS).

Aunque es ampliamente usado, el suero tiene muchas limitaciones. Contiene niveles elevados de numerosas proteínas que interfieren con las cantidades limitadas de la proteína de interés deseada producida por las células. Estas proteínas derivadas del suero deben ser separadas del producto durante el tratamiento en dirección descendente, como la purificación de la proteína de interés, lo que complica el procedimiento y aumenta el coste.

El advenimiento de la BSE (encefalopatía espongiforme bovina), una enfermedad neurodegenerativa transmisible del ganado con un período prolongado de latencia o incubación, ha elevado las preocupaciones reguladoras acerca del uso de sueros derivados de animales en la preparación de productos biológicamente activos.

Por lo tanto, hay una gran demanda para el desarrollo de medios alternativos exentos de suero animal que apoyen el crecimiento de células y mantengan las células durante la preparación de productos biológicamente activos.

Generalmente, los medios de cultivos de células comprenden muchos componentes de categorías diferentes, como aminoácidos, vitaminas, sales, ácidos grasos y compuestos adicionales:

- Aminoácidos: por ejemplo, el documento US 6.048.728 (Inlow et al.) describe que los siguientes aminoácidos pueden ser usados en un medio de cultivo celular: alanina, arginina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, triptófano, tirosina, treonina y valina.

- Vitaminas: el documento US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) o el documento US 5.811.299 (Renner et al.), por ejemplo, describen que pueden ser usadas las siguientes vitaminas en un medio de cultivo celular: biotina, pantotenato, cloruro de colina, ácido fólico, mio-inositol, niacinamida, piridoxina, riboflavina, vitamina B12, tiamina o putrescina.

- Sales: por ejemplo, el documento US 6.399.381 (Blum et al.) describe un medio que comprende CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, selenito de sodio, CuSO4, ZnCl2. Otro ejemplo de un documento que describe sales inorgánicas que pueden ser usadas en un medio de cultivo es US 2003/0153042 (Arnold et al.), que describe un medio que comprende CaCl2, KCl, MgCl2, NaCl, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, CuCl2.2H2O, ZnCl2.

- Ácidos grasos: los ácidos grasos que se conoce que se usan en los medios son ácido araquidónico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, así como metil-beta-ciclodextrina, véase, por ejemplo, el documento US 5.045.468 (Darfler). Debe apreciarse que la ciclodextrina no es un lípido por sí misma, sino que tiene la capacidad de formar un complejo con lípidos y, por tanto, es usada para solubilizar lípidos en el medio de cultivo celular.

- Componentes adicionales, en particular usados en el marco de medios de cultivos de células exentos de suero, son compuestos como glucosa, glutamina, piruvato de Na, insulina o etanolamina (por ejemplo, documento EP 274.445) o un agente protector como Pluronic F68. El Pluronic® F68 (también conocido como Poloxamer 188) es un copolímero de bloques de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO).

Los “medios básicos” estándar son también conocidos por un experto en la técnica. Estos medios contienen ya varios de los componentes de medios anteriormente mencionados. Ejemplos de estos medios que son ampliamente aplicados son medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), DMEM F12 (1:1), mezcla F-10 nutriente de Ham, medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), MCDB131 o medio E de William. Estos medios comerciales están disponibles, por ejemplo en la empresa Gibco, Invitrogen.

Los metales como zinc (Zn) y cobre (Cu) están involucrados en las reacciones metabólicas (Vallee y Falchuk, 1993,

o Lindner, 1991).

El zinc es esencial para la estructura y la función de un gran número de macromoléculas y para muchas reacciones enzimáticas. Desempeña una función catalítica, co-catalítica o estructural en el apropiado plegado de las proteínas. El Zn-ATP es necesario para la síntesis de piridoxal-5-fosfato y para flavina adenosina dinocleótido (FAD), dos coenzimas esenciales para la síntesis de animas biogénicas y el metabolismo de monoamina oxidasa.

La actividad del zinc en la protección de estructuras biológicas del deterioro por radicales libres puede ser debida a diversos factores: mantenimiento del nivel adecuado de metaloproteínas, que son también depuradores de radicales libres, como un componente esencial de superóxido dismutasa o como un agente protector para tioles y en la evitación de la interacción de grupos químicos con hierro para formar radicales libres.

Además de eso, la presencia de Zn evita la peroxidación de lípidos. El zinc es también un efector de la polimerización de tubulina y actúa in vitro sobre la formación y estabilización de filamentos de actina. El zinc es también un componente del resto digitador de zinc de proteínas de unión de DNA, que es un resto común en proteínas de transcripción.

Los iones de zinc existen principalmente en forma de complejos con proteínas y ácidos nucleicos y participan en todos los aspectos del metabolismo intermedio, transmisión y regulación de la expresión de información genética, almacenamiento, síntesis y acción de hormonas péptidas y el mantenimiento estructural de cromatina y biomembranas.

El cobre es también un elemento residual importante para la función de muchas enzimas celulares. Los iones de cobre pueden adoptar distintos estados redox, Cu (II) oxidado o Cu (I) reducido, permitiendo que el metal desempeñe una función clave en la fisiología celular como un cofactor catalítico en la química redox de las enzimas. Funciona en un grupo de oxidasas de cobre que incluyen citocromo c oxidasa, tirosinasa, dopamina-β-monooxigenasa, amina oxidasas, y lisil oxidasa. El cobre participa también en la respiración mitocondrial, laomeostasis del hierro como un componente de ceruloplasmina, depurador de radicales libres y reticulación de elsatina.

Los medios exentos de suero que contienen iones metálicos como iones de zinc o cobre son conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de los documentos US 6.048.728 (Inlow et al.), US 4.767.704 (Cleveland et al.) o WO 01/16294 (Life Technologies Inc.). Sin embargo, estos documentos no describen ningún efecto mejorados de la productividad de estos iones si son añadidos a concentraciones específicas de un medio de producción estándar.

Para el desarrollo y suministro de productos biológicamente activos, como proteínas terapéuticas o vacunas, deben ser producidas grandes cantidades. Las células adecuadas que son ampliamente usadas para la producción de polipéptidos son células de ovarios de hámster chinos (CHO).

Las células CHO fueron cultivadas en primer lugar por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de una biopsia de un ovario de hámster chino hembra. A partir... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la producción de hormona del crecimiento, que comprende la etapa de cultivar células de una línea celular que expresa hormona del crecimiento en un medio de cultivo celular exento de componentes derivados de suero animal, comprendiendo el medio zinc en una concentración que varía en el intervalo de 0,2 µM a 1,75 µM y cobre en una concentración que varía en el intervalo de 10 nM a 75 nM e iones férricos en una concentración de 5 ó 6 µM.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que medio comprende zinc a 0,2 µM.

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende zinc a 0,5 µM.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende zinc en forma de sulfato de zinc.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende cobre a 25 nM.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende cobre en forma de sulfato de cobre.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende iones férricos en forma de citrato férrico y/o nitrato férrico.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende adicionalmente los componentes de un medio básico.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que el medio básico es medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM).

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la hormona del crecimiento es expresada bajo el control de un promotor de metalotioneína (MT).

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el promotor de metalotioneína es el promotor MT-1 de ratón.

12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la etapa de recoger la hormona del crecimiento a partir del cultivo celular.

13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente purificar la hormona del crecimiento.

14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente formular la hormona del crecimiento purificada con un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una composición farmacéutica.

15. El procedimiento o uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la hormona del crecimiento es hormona del crecimiento humana.

16. Uso de un medio como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la producción de hormona del crecimiento.

17. Uso de un medio como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para el mantenimiento de células en cultivo durante la fase de producción de hormona del crecimiento.

18. Uso según la reivindicación 16 ó 17, en el que la hormona del crecimiento es hormona del crecimiento humana.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que las células son células C127 de ratón.