LIPOPÉPTIDOS INMUNOGÉNICOS NOVEDOSOS QUE COMPRENDEN EPÍTOPOS DE CÉLULAS T COOPERADORAS Y DE CÉLULAS B.

Lipopéptidos inmunogénicos novedosos que comprenden epítopos de células T cooperadoras y de células B Campo de la invención La presente invención se refiere en general al campo de la inmunología, y más particularmente a reactivos para generar respuestas de anticuerpos y/o celulares contra un inmunógeno peptídico, y a métodos para usar dichos reactivos para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto, o para la vacunación de un sujeto. Incluso más específicamente, la presente invención se refiere a lipopéptidos novedosos que tienen actividad inmunogénica potenciada, a formulaciones y a composiciones de vacuna que comprenden dichos lipopéptidos, tales como, por ejemplo, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y a métodos para preparar y usar las formulaciones y composiciones de vacuna de la invención. Antecedentes de la invención 1. General Esta memoria descriptiva contiene información de secuencia de aminoácidos preparada usando Patentln Versión 3.1, presentada en el presente documento tras el resumen. Cada secuencia se identifica en la lista de secuencias mediante el indicador numérico <210> seguido por el identificador de secuencia (por ejemplo, <210>1, <210>2, etc.). La longitud de cada secuencia y el organismo fuente se indican mediante la información proporcionada en el campo de indicador numérico <211> y <213>, respectivamente. Las secuencias a las que se hace referencia en la memoria descriptiva se definen mediante la expresión SEQ ID NO:, seguida por el identificador de secuencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 se refiere a la secuencia designada como <400>1). Tal como se usa en el presente documento, la expresión derivado de debe considerarse como que indica que puede obtenerse un número entero especificado a partir de una fuente particular aunque no necesariamente de manera directa de esa fuente. En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra comprender, o variaciones tales como comprende o que comprende, se entenderá que implican la inclusión de una etapa o elemento o número entero establecidos o grupo de etapas o elementos o números enteros pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros. La presente invención se realiza sin experimentación excesiva usando, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, virología, tecnología de ADN recombinante, síntesis de péptidos en disolución, síntesis de péptidos en fase sólida e inmunología. Tales procedimientos se describen, por ejemplo, en los siguientes textos que se incorporan como referencia: 1. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Segunda Edición (1989), los Vol I, II, y III completos; 2. DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I y II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, texto completo; 3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, texto completo, y particularmente los artículos en el mismo de Gait, págs.1-22; Atkinson et al., págs. 35-81; Sproat et al., págs. 83- 115; y Wu et al., págs 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, texto completo; 5. Animal Cell Culture: Practical Approach, Tercera Edición (John R.W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, texto completo; 6. Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, texto completo; 7. Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); 8. Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), series completas; 9. J.F. Ramalho Ortigao, The Chemistry of Peptide Synthesis En: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Alemania); 2 E03783851 11-10-2011   10. Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342 11. Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154. 12. Barany, G. y Merrifield, R.B. (1979) en The Peptides (Gross, E. y Meienhofer, J. eds.), vol. 2, págs. 1-284, Academic Press, Nueva York. 13. Wünsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptidon en Houben-Weyls Methoden der Organischen Chemie (Müler, E., ed.), vol. 15, 4ª ed., Partes 1 y 2, Thieme, Stuttgart. 14. Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg. 15. Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg. 16. Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474. 17. Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications). Descripción de la técnica relacionada La inmunoterapia o vacunación son técnicas atractivas para la profilaxis o terapia de una amplia variedad de trastornos, tales como, por ejemplo, ciertas enfermedades infecciosas o cánceres. Sin embargo, la aplicación y el éxito de tales tratamientos están limitados en parte por la escasa inmunogenicidad del antígeno diana. Muchos péptidos, glicopéptidos, lípidos, lipopéptidos, hidratos de carbono etc., son escasamente inmunogénicos. Se usan varias técnicas para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto contra un inmunógeno peptídico. Se conoce utilizar una formulación adyuvante que es extrínseca al inmunógeno peptídico (es decir, se mezcla con el inmunógeno antes de su uso), tal como, por ejemplo, adyuvante completo de Freund (CFA), para potenciar la respuesta inmunitaria de un sujeto contra un inmunógeno peptídico. Sin embargo, muchos de los adyuvantes disponibles actualmente son demasiado tóxicos para su uso en seres humanos, o simplemente son ineficaces. Además, los adyuvantes de este tipo requieren la formulación previa con el inmunógeno peptídico inmediatamente antes de la administración, teniendo tales formulaciones a menudo una baja solubilidad o siendo insolubles. Los lipopéptidos, en los que un resto lipídico que se sabe que actúa como un adyuvante se acopla covalentemente a un inmunógeno peptídico, pueden ser capaces de potenciar la inmunogenicidad de un péptido inmunogénico de otro modo débil en ausencia de un adyuvante extrínseco [Jung et al., Angew Chem, Int Ed Engl 10, 872, (1985); Martinon et al., J Immunol 149, 3416, (1992); Toyokuni et al., J Am Chem Soc 116, 395, (1994); Deprez, et al., J Med Chem 38, 459, (1995); y Sauzet et al., Vaccine 13, 1339, (1995); Benmohamed et al., Eur. J. Immunol. 27, 1242, (1997); Wiesmuller et al., Vaccine 7, 29, (1989); Nardin et al., Vaccine 16, 590, (1998); Benmohamed, et al. Vaccine 18, 2843, (2000); y Obert, et al., Vaccine 16, 161, (1998)]. Los lipopéptidos adecuados no muestran ninguno de los efectos secundarios perjudiciales asociados con las formulaciones de adyuvante, y se han observado tanto respuestas de anticuerpos como celulares contra lipopéptidos. Se conocen varios ácidos grasos diferentes para su uso en restos lipídicos. Los ácidos grasos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, grupos palmitoílo, miristoílo, estearoílo y decanoílo o, más generalmente, se piensa que es útil cualquier grupo de ácido graso C2 a C30 saturado, monoinsaturado o poliinsaturado. El lipoaminoácido N-palmitoil-S-[2,3-bis(palmitoiloxi)propil]cisteína, también conocido como Pam3Cys o Pam3Cys-OH (Wiesmuller et al., Z. PhysioLChem. 364 (1983), p593), es una versión sintética del resto N-terminal de la lipoproteína de Braun que abarca las membranas interna y externa de bacterias Gram negativas. Pam3Cys tiene la estructura de fórmula (I): 3 E03783851 11-10-2011   La patente estadounidense n.º 5.700.910 concedida a Metzger et al (23 de diciembre de 1997) describe varias Nacil-S-(2-hidroxialquil)cisteínas para su uso como productos intermedios en la preparación de lipopéptidos que se usan como adyuvantes sintéticos, estimulantes de linfocitos B, estimulantes de macrófagos o vacunas sintéticas. Metzger et al. también enseñan el uso de tales compuestos como productos intermedios en la síntesis de Pam3Cys- OH (Wiesmuller et al., Z. Physiol. Chem. 364, pág. 593, 1983), y de lipopéptidos que comprenden estos lipoaminoácidos o un análogo de los mismos en el extremo N-terminal. Se ha demostrado que Pam3Cys puede estimular respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de virus contra células infectadas con el virus Influenza (Deres et al., Nature 342, 561, 1989) y provocar la formación de anticuerpos protectores contra la fiebre aftosa (Wiesmuller et al., Vaccine 7, 29, 1989; patente estadounidense n.º 6.024.964 concedida a Jung et al., 15 de febrero de 2000) cuando se acopla a los epítopos apropiados. Recientemente se ha sintetizado Pam2Cys (también conocido como dipalmitoil-S-gliceril-cisteína o S-[2,3bis(palmitoiloxi)propil]cisteína,... [Seguir leyendo]

1. Lipopéptido que comprende un polipéptido conjugado con uno o más restos lipídicos en el que: (i) dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de un epítopo de células T cooperadoras (Th) y la secuencia de aminoácidos de un epítopo de células B, en el que dichas secuencias de aminoácidos son diferentes; y (b) uno o más residuos de lisina interna o residuos de análogos de lisina interna para la unión covalente de cada uno de dichos restos lipídicos a través del grupo épsilon-amino o el grupo de cadena lateral terminal de dicha lisina o análogo de lisina; y (ii) cada uno de dicho uno o más restos lipídicos se une covalentemente a un grupo épsilon-amino de dicho uno o más residuos de lisina interna o a un grupo de cadena lateral terminal de dicho uno o más residuos de análogos de lisina interna; en el que el residuo de lisina interna o el residuo de análogo de lisina interna al que se une un resto lipídico se sitúa (a) entre el epítopo de Th y el epítopo de células B, o (b) dentro del epítopo de Th. 2. Lipopéptido según la reivindicación 1, en el que el lípido se une al grupo épsilon-amino de un residuo de lisina. 3. Lipopéptido según la reivindicación 1 ó 2, que comprende dos restos lipídicos. 4. Lipopéptido según la reivindicación 3, en el que un residuo de lisina interna al que se une un resto lipídico se sitúa entre el epítopo de Th y el epítopo de células B y un residuo de lisina interna al que se une un resto lipídico se sitúa dentro del epítopo de Th. 5. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto lipídico tiene una estructura de fórmula general (VII): en la que: (i) X se selecciona del grupo que consiste en azufre, oxígeno, disulfuro (-S-S-), y metileno (-CH2 - ), y amino (-NH-); (ii) m es un número entero que es 1 ó 2; (iii) n es un número entero desde 0 hasta 5; (iv) R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, carbonilo (-CO-), y R-CO- en el que R se selecciona del grupo que consiste en alquilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, alquenilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, y alquinilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, amino, oxo, acilo o cicloalquilo; 86   (v) R2 se selecciona del grupo que consiste en R-CO-O-, R-O-, R-O-CO-, R-NH-CO-, y R-CO-NH-, en el que R se selecciona del grupo que consiste en alquilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, alquenilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, y alquinilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, amino, oxo, acilo o cicloalquilo; y (vi) R3 se selecciona del grupo que consiste en R-CO-O-, R-O-, R-O-CO-, R-NH-CO-, y R-CO-NH-, en el que R se selecciona del grupo que consiste en alquilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, alquenilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, y alquinilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, alquenilo o alquinilo está opcionalmente sustituido con un grupo hidroxilo, amino, oxo, acilo o cicloalquilo y en el que cada uno de R1, R2 y R3 son iguales o diferentes. 6. Lipopéptido según la reivindicación 5, en el que X es azufre; m y n son ambos 1; R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, y R-CO-, en el que R es un grupo alquilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono; y R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en R-CO-O-, R-O-, R-O-CO-, R-NH-CO-, y R-CO-NH-, en el que R es un grupo alquilo que tiene de 7 a 25 átomos de carbono. 7. Lipopéptido según la reivindicación 6, en el que R se selecciona del grupo que consiste en: palmitoílo, miristoílo, estearoílo, lauroílo, octanoílo y decanoílo. 8. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el lípido está contenido dentro de un resto de lipoaminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Pam2Cys, Pam3Cys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys. 9. Lipopéptido según la reivindicación 8, en el que el resto de lipoaminoácido tiene la estructura de fórmula (II): 10. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el resto lipídico tiene la siguiente fórmula general (VIII): en la que: (i) R4 se selecciona del grupo que consiste en (i) un residuo de alfa-acil-ácido graso que consiste en entre aproximadamente 7 y aproximadamente 25 átomos de carbono; (ii) un residuo de alfa-alquil-beta-hidroxiácido graso; (iii) un beta-hidroxiéster de un residuo de alfa-alquil-beta-hidroxiácido graso; y (iv) un residuo de lipoaminoácido; y (ii) R5 es hidrógeno o la cadena lateral de un residuo de aminoácido. 11. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el resto lipídico está separado del resto peptídico por un espaciador. 12. Lipopéptido según la reivindicación 11, en el que el espaciador comprende arginina, serina o ácido 6- 87   aminohexanoico. 13. Lipopéptido según la reivindicación 11 ó 12, en el que el espaciador consiste en un homodímero de serina. 14. Lipopéptido según la reivindicación 11 ó 12, en el que el espaciador consiste en un homodímero de arginina. 15. Lipopéptido según la reivindicación 11 ó 12, en el que el espaciador consiste en ácido 6-aminohexanoico. 16. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la lisina interna o el análogo de lisina interna está anidado dentro de una secuencia de aminoácidos sintéticos que tiene baja inmunogenicidad. 17. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el epítopo de células T cooperadoras es un epítopo de células T cooperadoras de hemaglutinina del virus Influenza o un epítopo de células T cooperadoras de la proteína F del virus del moquillo canino (F-VMC). 18. Lipopéptido según la reivindicación 17, en el que el epítopo de células T cooperadoras de hemaglutinina del virus Influenza comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 18. 19. Lipopéptido según la reivindicación 17, en el que el epítopo de células T cooperadoras de la proteína F-VMC comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 24. 20. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que el epítopo de células B procede de una proteína inmunogénica, lipoproteína, o glicoproteína de un virus, un organismo procariota, o un organismo eucariota. 21. Lipopéptido según la reivindicación 20, en el que el epítopo de células B procede de la proteína M de un Streptococcus del grupo A o una hormona peptídica de un mamífero. 22. Lipopéptido según la reivindicación 21, en el que el epítopo de células B comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 101. 23. Lipopéptido según la reivindicación 21, en el que la hormona peptídica es una hormona digestiva o una hormona peptídica reproductora. 24. Lipopéptido según la reivindicación 23, en el que la hormona peptídica es gastrina, pentagastrina u hormona de liberación de hormona luteinizante (LHRH) o un fragmento de las mismas. 25. Lipopéptido según la reivindicación 24, que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 102 o SEQ ID NO: 113. 26. Lipopéptido según la reivindicación 20, que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. 27. Lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) GALNNRFQIKGVELKSEHWSYGLRPG (SEQ ID NO: 5); (ii) GALNNRFQIKGVELKSKEHWSYGLRPG (SEQ ID NO: 7); (iii) KLIPNASLIENCTKAELKHWSYGLRPG (SEQ ID NO: 9); (iv) KLIPNASLIENCTKAELKGLRPG (SEQ ID NO: 13); (v) KLIPNASLIENCTKAELHWSYGLRPG (SEQ ID NO: 103); (vi) KLIPNASLIENCTKAELGLRPG (SEQ ID NO: 104); (vii) KLIPNASLIENCTKAELKQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK (SEQ ID NO: 105); 88   (viii) KLIPNASLIENCTKAELKKQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK (SEQ ID NO: 106); (ix) GALNNRFQIKGVELKSKQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK (SEQ ID NO: 107); (x) GALNNRFQIKGVELKSKKQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDKVK (SEQ ID NO: 108); (xi) KLIPNASLIENCTKAELGWMDF (SEQ ID NO: 109); (xii) KLIPNASLIENCTKAELKGWMDF (SEQ ID NO: 110); (xiii) GALNNRFQIKGVELKSGWMDF (SEQ ID NO: 111); y (xiv) GALNNRFQIKGVELKSKGWMDF (SEQ ID NO: 112). 28. Lipopéptido que comprende un polipéptido conjugado con uno o más restos lipídicos en el que: (i) dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de un epítopo de células T cooperadoras (Th) y la secuencia de aminoácidos de un epítopo de células B, en el que dichas secuencias de aminoácidos son diferentes; y (b) uno o más residuos de lisina interna para la unión covalente de cada uno de dichos restos lipídicos a través del grupo épsilon-amino de dicho uno o más residuos de lisina; (ii) cada uno de dicho uno o más restos lipídicos se une covalentemente a un grupo épsilon-amino de dicho uno o más residuos de lisina interna; y (iii) dicho lipopéptido tiene la fórmula general (VI): en la que: epítopo es un epítopo de células T cooperadoras o epítopo de células B; A está o bien presente o bien ausente y consiste en un espaciador de aminoácidos de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 aminoácidos de longitud; n es un número entero que tiene un valor de 1, 2, 3 ó 4; X es un grupo de cadena lateral terminal seleccionado del grupo que consiste en NH, O y S; Y está o bien presente o bien ausente y consiste en un espaciador de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 aminoácidos de longitud, en el que dicho espaciador comprende arginina, serina o ácido 6-aminohexanoico; y Z es un resto de lipoaminoácido seleccionado del grupo que consiste en Pam2Cys, Pam3Cys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys. 29. Lipopéptido según la reivindicación 28, en el que el epítopo de células B comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4. 89   30. Lipopéptido según la reivindicación 28, en el que: (i) el epítopo de células B comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 101; (ii) Y está presente y consiste en un homodímero de serina; y (iii) Z consiste en Pam2Cys. 31. Lipopéptido según la reivindicación 30, en el que el epítopo de células T cooperadoras comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 24 y en el que se une un resto lipídico al polipéptido a través del grupo épsilon-amino de un residuo de lisina dentro de SEQ ID NO: 24. 32. Lipopéptido según la reivindicación 28, en el que: (i) el epítopo de células B comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 102; (ii) Y está presente y consiste en un homodímero de serina; y (iii) Z consiste en Pam2Cys. 33. Composición que comprende el lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. 34. Composición farmacéutica para provocar una respuesta inmunitaria humoral contra un epítopo de células B antigénico en un sujeto, comprendiendo la composición el lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32. 35. Composición farmacéutica según la reivindicación 34, siendo la composición para la administración por vía intranasal. 36. Composición farmacéutica según la reivindicación 34, siendo la composición para administración mediante inyección. 37. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en la que el epítopo de células B antigénico procede de un agente patógeno. 38. Composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, comprendiendo además la composición un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. 39. Agente anticonceptivo que comprende el lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que el epítopo de células B procede de una hormona reproductora o receptor de hormona. 40. Vacuna que comprende el lipopéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32.   91   92   93   94     96   97   98   99     101   102   103   104     106   107   108   109     111   112   113   114