Procedimiento para preparar células dendríticas reactivas a un antígeno,

que comprende: proporcionar una representa de células dendríticas; y poner en contacto las células dendríticas con el antígeno, un estimulante de CD40 y con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de células dendríticas reactivas, y en particular a la utilización de las células dendríticas reactivas para la vacunación tumoral, con el fin de crear un modelo animal de insuficiencia orgánica y para la utilización en el cribado in vitro de fármacos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las infecciones e inflamación se consideran en la actualidad factores de riesgo importantes de enfermedades cardiovasculares1, la causa principal de muerte en las sociedades occidentales. En efecto, la elevación de marcadores inflamatorios en el suero predice el prognóstico de los pacientes con enfermedades cardiacas coronarias2 y cardiomiopatía dilatada3,4. En particular la cardiomiopatía dilatada, la causa más común de

5,6,7

insuficiencia cardiaca en pacientes jóvenes, se ha asociado a respuestas autoinmunológicas tras la infección con virus cardiotrópicos, debido a que muchos de

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estos pacientes representan autoanticuerpos contra proteínas cardiacas. Se han implicado mecanismos autoinmunológicos similares en la insuficiencia cardiaca tras la infección con el protozoo Trypanozoma cruzii7. La autoinmunidad se caracteriza mediante varios criterios clásicos24, incluyendo autoantígenos definidos, especificidad de órgano y células T autorreactivas y/o autoanticuerpos que pueden transferir la enfermedad.

Los modelos animales apoyan la idea de que la infección microbiana puede desencadenar respuestas autoinmunológicas contra el tejido cardiaco7. Los ratones con fondos genéticos definidos desarrollan miocarditis prolongada, con células T autorreactivas, tras la infección por Coxsackie B37 y Trypanozoma cruzii9. En las mismas cepas de ratón, la inmunización con α-miosina específica del corazón o un epítopo de dieciséis aminoácidos de la cadena pesada de la α-miosina conjuntamente con un

7,10,11

adyuvante fuerte induce miocarditis mediada por células T. Cabe mencionar que se ha demostrado que los corazones de ratones normales contienen un gran número de células residentes en el tejido que presentan péptidos endógenos específicos del corazón12 . Sin embargo, se desconoce si las células dendríticas que presentan autoantígenos endógenos podrían contribuir a una enfermedad cardiaca autoinmunológico y a la posible insuficiencia cardiaca. Se requiere un modelo animal que permita a los investigadores estudiar los mecanismos mediante los que se desarrolla la cardiomiopatía en pacientes jóvenes y, más importante, que permita identificar los compuestos que interfieren con dicho desarrollo.

Las células dendríticas son agentes cruciales en la inducción de respuestas

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inmunológicas específicas de antígeno, así como de inmunotolerancia. Las células dendríticas inmaduras se alojan en los tejidos periféricos, en los que muestrean activamente su ambiente mediante endocitosis y macropinocitosis. Tras encontrarse con un patógeno, experimentan un programa del desarrollo denominado maduración de células dendríticas, que incluye la inducción de actividad coestimulantea, procesamiento de antígenos, expresión incrementada de moléculas del MHC, y migración a los nódulos linfáticos, donde pueden cebar células T específicas de antígeno no expuestas 13 . Las células dendríticas también procesan antígenos endógenos procedentes de residuos y

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células muertas. Por lo tanto, se ha propuesto que las células dendríticas podrían

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inducir las células T autorreactivas en el caso de que se activasen correctamente. Existe evidencia creciente de que el procesamiento de células moribundas y de los propios tejidos en ausencia de estimulación apropiada convierte a las células dendríticas en tolerogénicas para las respuestas inmunológicas mediadas por células T CD8+18 y T CD4+19 . La investigación actual se ha centrado, por lo tanto, en el papel de las células dendríticas en el mantenimiento de la autotolerancia. Algunas investigaciones señalan que las células dendríticas pueden inducir inflamación específica de órgano en un modelo transgénico de expresión de antígenos víricos20, pero todavía sólo se dispone de datos indirectos de que las células dendríticas activadas puedan inducir autoinmunidad frente a

13,21

autoantígenos. Además, nunca se ha demostrado que las células dendríticas pulsadas con autoproteínas sean realmente capaces de inducir autoinmunidad en ratones "no expuestos". Las células dendríticas expresan múltiples receptores de tipo Toll y, por lo tanto, estas células se encuentran idealmente dispuestas en la interfaz entre las inmunidades adaptativa e innata21. El sistema inmunológico innato es una antigua forma universal de defensa del huésped frente a la infección21 .

Las células dendríticas comprenden una población celular heterogénea con una distribución de tejidos amplia. La utilización de células dendríticas para la investigación y para aplicaciones más prácticas se ha visto limitada por la baja frecuencia de las células dendríticas en la sangre periférica, la limitada accesibilidad de los órganos linfoides y el estado terminal de diferenciación de las células dendríticas. El número de células dendríticas necesario para la activación mediante los procedimientos actuales es del orden de por lo menos 1x106 células. Se requiere un procedimiento para la activación de las células dendríticas que exija menos células, del orden de entre 5x104 y 2x105 células.

La investigación ha demostrado que el sistema inmunológico puede eliminar las células tumorales en cierto grado; los tumores, sin embargo, con frecuencia prevalecen. Se han propuesto diversos procedimientos para la inmunoterapia en el tratamiento de cánceres, pero todavía no se dispone de un procedimiento terapéutico que induzca con éxito una respuesta inmunoterapéutica eficaz y específica contra un tumor diana. Se requiere un procedimiento que genere consistente y específicamente una respuesta inmunológica contra un tumor in vivo, resultando en la erradicación del mismo.

Se da a conocer en el documento WO nº 03/020889 A un procedimiento para la mutación de las DC con antígenos y un modificador de la respuesta inmunológica.

Weir et al. (Inmunology and Cell Biology 80(1):14-20, (2002)) describen la utilización de células dendríticas para la inducción de encefalomielitis autoinmunológica en ratones mediante la puesta en contacto de DC con un autoantígeno y la toxina pertussis como coestimulante.

Steinbrink et al. (Journal of Immunology 159(10):4472-4780, (1997)) demostraron la eficacia de IL-10 sobre DC maduras e inmaduras. Las DC inmaduras tratadas con IL-10 no podían activar las células T CD4+ posteriormente.

Eriksson et al. (Journal of Experimental Medicine 197(3):323-331, (2003)) investigaron todos los efectos de IL-1 sobre la activación de las DC. Se demostró que los ratones con un defecto en su receptor de IL-1 eran inmunes frente a la miocarditis autoinmunológica experimental mediada por DC.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se da a conocer un procedimiento para activar las células dendríticas y que sean reactivas frente a un antígeno seleccionado. En este procedimiento, se exponen las células dendríticas al antígeno seleccionado, a un estimulante de CD40 y a un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR), que activa una ruta de TLR en las células dendríticas.

En el caso de que el antígeno seleccionado al que se exponen las células dendríticas sea un autoantígeno o un antígeno específico de tejido, la reintroducción de las células dendríticas activadas en un animal no humano cuyos tejidos sean portadores de dicho antígeno conduce al desarrollo de enfermedad autoinmunológica en el animal. Lo expuesto anteriormente proporciona un procedimiento para crear un modelo animal de una enfermedad autoinmunológico o de un daño autoinmunológico específico de tejido. La selección de un autoantígeno asociado a una enfermedad autoinmunológica permite modelar la enfermedad autoinmunológico, tal como se describe en la presente memoria.

En el caso de que el antígeno seleccionado al que se exponen las células dendríticas sea un antígeno tumoral, la reintroducción de las células dendríticas activadas en el paciente que presenta un tumor...

1. Procedimiento para preparar células dendríticas reactivas a un antígeno, que comprende:

proporcionar una representa de células dendríticas; y

poner en contacto las células dendríticas con el antígeno, un estimulante de CD40 y con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el antígeno durante un periodo de tiempo adecuado, seguido de la puesta en contacto de las células dendríticas con por lo menos un estimulante de TLR durante un periodo de tiempo adecuado.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que las células dendríticas se proporcionan a partir del tejido de un animal, siendo el tejido seleccionado de entre el grupo constituido por sangre periférica, médula ósea, bazo y nódulo linfático.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el estimulante de TLR se selecciona de entre el grupo constituido por lipopolisacárido, poli(I:C), CpG-ODN y peptidoglicano.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el antígeno durante desde aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el estimulante de TLR durante hasta cuatro horas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el estimulante de TLR durante hasta dos horas.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células dendríticas son CD11c+, CD11b+.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células dendríticas son las CD11c+.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con antígeno en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 a 20 µg/ml.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con un anticuerpo anti-CD40.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo anti-CD40 se encuentra a una concentración comprendida en el intervalo de aproximadamente 3 a 5 µg/ml.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el antígeno es un autoantígeno o un antígeno tumoral.

14. Procedimiento para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un tumor en un animal, que comprende proporcionar un antígeno tumoral expresado por el tumor, proporcionar una representa de células dendríticas procedentes del animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al antígeno tumoral in vitro mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el medicamento está destinado a la reintroducción de las células dendríticas reactivas en el animal.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el animal es un humano.

16. Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que las células dendríticas están destinadas a la reintroducción en el animal mediante infusión intravenosa o mediante inyección subcutánea.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que las células dendríticas se cultivan en presencia de una citoquina previamente a la puesta en contacto con el antígeno.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la citoquina es la IL-10.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el tumor se selecciona de entre un grupo constituido por un melanoma, un carcinoma de células renales, una leucemia y un linfoma.

20. Procedimiento de preparación de un modelo animal no humano de una

enfermedad autoinmunológica, que comprende proporcionar un antígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al antígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el antígeno es el colágeno

o una proteína de la matriz de cartílago y la enfermedad autoinmunológica es la artritis.

22. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el antígeno es un antígeno específico del corazón y la enfermedad autoinmunológica es la miocarditis.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que el antígeno es el péptido myhc-α.

24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el animal se selecciona de entre el grupo constituido por un ratón, una rata y un cerdo.

25. Procedimiento de preparación de un modelo animal no humano de insuficiencia orgánica, que comprende proporcionar un autoantígeno específico de órgano, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al autoantígeno mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el antígeno es el péptido myhc-α.

27. Modelo animal de una enfermedad autoinmunológica preparado mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.

28. Procedimiento para cribar un compuesto candidato para su capacidad de modular el desarrollo de una enfermedad autoinmunológica en un no humano, que comprende proporcionar un autoantígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al autoantígeno mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el compuesto candidato en un momento seleccionado de entre antes del contacto con el autoantígeno, durante el contacto con el autoantígeno, después del contacto con el autoantígeno y antes del contacto con el estimulante de TLR, durante el contacto con el estimulante de TLR y

después del contacto con el estimulante de TLR, y comparar la reacción autoinmunológica en el animal con la reacción autoinmunológica en un animal tratado con las células dendríticas que se han convertido en reactivas al mismo autoantígeno y no expuestas al compuesto.