DISPOSITIVO Y PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE ANTÍGENOS DE GRUPOS SANGUÍNEOS.

Dispositivo y procedimiento para la determinación simultánea de antígenos de grupos sanguíneos La invención se refiere a un dispositivo para ensayos multiparamétricos de flujo lateraldiagonal, particularmente en el campo de la serología de grupos sanguíneos, para la determinación cualitativa o cuantitativa simultánea de varios analitos en una muestra líquida, siendo los analitos antígenos o epítopos de antígenos de grupos sanguíneos, que comprende una membrana con una zona de aplicación para la aplicación de la muestra líquida, al menos dos zonas indicadoras que pueden interactuar con el analito o los analitos y al menos una región de absorción, que absorbe el líquido después de pasar por las zonas indicadoras, encontrándose las zonas indicadoras entre la zona de aplicación y una región de absorción, caracterizado porque las direcciones de flujo desde la zona de aplicación a través de las zonas indicadoras respectivas hasta una región de absorción (trayectorias de flujo) son esencialmente paralelas y se presentan al menos dos trayectorias de flujo distintas, estando dispuestas las zonas indicadoras de modo que el líquido de muestra no atraviesa más de una zona indicadora por trayectoria de flujo, y las zonas indicadoras comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra antígenos de grupos sanguíneos y/o lectinas o fragmentos de las mismas contra antígenos de grupos sanguíneos. La invención se refiere además a un procedimiento para la determinación de varios analitos en una muestra líquida, que comprende la aplicación de la muestra sobre la zona de aplicación de una membrana del dispositivo según la invención, en el que esta muestra se presenta en cantidad suficiente para inducir que el líquido de muestra fluya en dirección a la región de absorción a través de las zonas indicadoras y para inducir que los analitos o sus derivados en el líquido de muestra formen un complejo en las zonas indicadoras, particularmente para la determinación simultánea de antígenos de grupos sanguíneos. En el diagnóstico serológico de grupos sanguíneos, se detectan de manera general parámetros que son de importancia especialmente en el contexto de transfusiones o de la enfermedad hemolítica neonatal. A este respecto, se trata entre otros de la detección de antígenos sobre la superficie de eritrocitos que son característicos de los grupos sanguíneos. Otros sistemas de antígenos importantes se localizan también sobre trombocitos, granulocitos, linfocitos, que igualmente desempeñan un papel en transfusión y/o trasplantación. De forma conocida, para la determinación de los antígenos de grupos sanguíneos se combinan los eritrocitos de la persona a ensayar (donante o receptor) con reactivos que contienen anticuerpos específicos de grupo sanguíneo. Habitualmente, se trata de ensayos líquidos en los que se prepara una preparación de ensayo mediante mezclado de una muestra que contiene eritrocitos con una muestra que contiene anticuerpos que están dirigidos contra una característica de grupo sanguíneo determinado. La preparación de ensayo se incuba después durante un intervalo definido y en condiciones definidas y después del término de la incubación, o directamente o después de una etapa de centrifugación, se examina o visualmente o con procedimientos ópticos una eventual aglutinación o adsorción de los eritrocitos. La medida de punto final predominante en la serología de grupos sanguíneos es como siempre la hemaglutinación. Para cada uno de los grupos sanguíneos a determinar, debe pipetearse una preparación propia, es decir, por ejemplo la determinación de los 9 grupos sanguíneos más importantes A, B, D, C, c, E, e, Cw y K requiere 9 preparaciones separadas sin el control. Los ensayos de flujo lateral encuentran numerosas aplicaciones hoy en día como ensayos rápidos, por ejemplo, como ensayos de embarazo, para la determinación de marcadores de infección o como cribado de drogas. Una disposición de ensayo de flujo lateral está compuesta de forma conocida por un soporte sólido al que se aplica una zona de aplicación para la muestra a examinar y una membrana de separación sobre la que están unidos elementos de unión, por ejemplo, anticuerpos o antígenos de captura, y sobre la que pueden detectarse reacciones de unión, y una región de absorción capaz de succión, que hace fluir la muestra a examinar a través de la membrana de separación. Las membranas de ensayo de ensayos de flujo lateral convencionales se describen generalmente con una separación similar a la cromatografía. El analito en la muestra se une específicamente a los elementos de unión fijados sobre una membrana, que generalmente se presentan dispuestos en bandas consecutivas o superpuestas en forma de zonas indicadoras. El complejo de formación se visualiza mediante partículas indicadoras que generalmente están ya presentes en la disposición deshidratadas en una almohadilla de liberación de conjugado. La almohadilla de liberación de conjugado está típicamente fijada entre la zona de aplicación y la membrana. Las partículas indicadoras coloreadas prerrecubiertas están recubiertas, por ejemplo, con un anticuerpo dirigido contra los analitos buscados. El formato habitual de ensayo de flujo lateral es el denominado ensayo de sándwich, en el que tanto la zona indicadora como las partículas indicadoras están cubiertos con ligandos dirigidos contra los analitos buscados, normalmente un anticuerpo. A este respecto, el ligando (elemento de unión) está inmovilizado en la membrana. El reactivo detector, normalmente un anticuerpo que está unido a partículas de poliestireno coloreadas o metales coloidales, está depositado en la almohadilla de liberación de conjugado de manera que se puede quitar por lavado. Este complejo de unión sirve como partícula indicadora. Después de la aplicación de la muestra a examinar, ésta última humedece muy rápidamente la almohadilla de liberación de conjugado, con lo que se movilizan las partículas indicadoras. Las partículas indicadoras migran con el frente líquido a lo largo de la membrana porosa. Un analito localizado en la muestra se une al anticuerpo que está acoplado a la partícula indicadora. Cuando la muestra pasa por la zona indicadora, se inmoviliza el complejo de analito/partícula indicadora en la zona indicadora mediante la reacción del analito con el anticuerpo unido en la zona indicadora, lo que conduce a una señal visible. Es un formato de ensayo conocido adicional para analitos pequeños con sólo un determinante antigénico único que no pueden unirse simultáneamente a dos anticuerpos, el denominado ensayo de competición. El reactivo detector unido a la partícula indicadora es normalmente una molécula idéntica o análoga al analito. Las partículas indicadoras están depositadas en la almohadilla de liberación de conjugado. Las partículas indicadoras migran con el frente líquido a lo largo de la membrana porosa. Cuando la muestra que contiene analito, y las partículas indicadoras (que - 2 -   también contienen eficazmente analito) pasan por la zona indicadora, se une una parte de las moléculas de analito de la muestra y una parte de las partículas indicadoras. Cuanto más analito se localice en la muestra, más eficaz competirá con la unión de las partículas indicadoras y más débil será la señal. De forma conocida, estas partículas indicadoras son predominantemente de oro coloidal o poliestireno, que se preparan y recubren con procedimientos conocidos por el experto. En los formatos de ensayos de flujo lateral típicos, se determinan indirectamente los analitos. Por determinación directa de un analito se entiende aquí que el analito está ya unido naturalmente a la partícula indicadora (por ejemplo, eritrocito). En el caso más común de determinación indirecta del analito, la muestra a ensayar contiene generalmente un componente no unido a célula, por ejemplo plasmático, como analito y son necesarios además de la muestra a ensayar dos componentes reactivos, a saber partículas indicadoras y elemento de unión. En la determinación indirecta, se une el analito en primer lugar a las partículas indicadoras disociadas de la almohadilla de liberación de conjugado, antes de inmovilizarse entonces en las zonas indicadoras este complejo mediante una segunda reacción con el elemento de unión. Con el uso de ensayos de flujo lateral convencionales con eritrocitos como partículas indicadoras que se han unido a los analitos a determinar, por ejemplo, antígenos específicos de grupos sanguíneos, se disponen hasta la fecha en las zonas indicadoras anticuerpos contra antígenos de los correspondientes grupos sanguíneos como elementos de unión en bandas consecutivas o superpuestas sólo en una trayectoria de flujo como, por ejemplo, antiA, antiB contra los antígenos de grupos sanguíneos... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para la determinación cualitativa o cuantitativa simultánea de varios analitos en una muestra líquida, siendo los analitos antígenos o epítopos de antígenos de grupos sanguíneos, que comprende una membrana (2) con - una zona de aplicación (5) para la aplicación de la muestra líquida, - al menos dos zonas indicadoras que pueden interactuar con el analito o los analitos y - al menos una región de absorción (3), que absorbe el líquido después de pasar por las zonas indicadoras, encontrándose las zonas indicadoras entre la zona de aplicación (5) y una región de absorción (3), caracterizado porque las direcciones de flujo desde la zona de aplicación (5) a través de las zonas indicadoras respectivas hasta una región de absorción (6) (trayectorias de flujo) son esencialmente paralelas y se presentan al menos dos trayectorias de flujo distintas, estando dispuestas las zonas indicadoras de modo que el líquido de muestra no cruza más de una zona indicadora por trayectoria de flujo, y las zonas indicadoras comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra antígenos de grupos sanguíneos y/o lectinas o fragmentos de las mismas contra antígenos de grupos sanguíneos. 2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que las zonas indicadoras están dispuestas en una serie diagonal, en forma de V, W, M, N o lineal. 3. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las zonas indicadoras comprenden en particular anticuerpos o fragmentos de anticuerpos anti-A, -B, -AB, -D, -C, -c, -E, -e, -Cw y/o -K. 4. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la membrana (2) está preferiblemente compuesta por polietileno, nitrocelulosa o nailon. 5. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que detrás de la zona de aplicación (5) y delante de las zonas indicadoras está dispuesto al menos un elemento sellante (4) sobre la membrana (2). 6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los componentes del dispositivo están aplicados sobre una capa de soporte (1) para el reforzamiento mecánico. 7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los componentes del dispositivo están integrados en una carcasa. 8. Uso del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 7 para el análisis de sangre, en particular para la determinación simultánea de los antígenos o epítopos de antígenos de grupos sanguíneos A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw y/o K. 9. Procedimiento para la determinación de varios analitos o sus derivados en una muestra líquida, en el que los analitos son antígenos o epítopos de antígenos de grupos sanguíneos, que comprende: la aplicación de la muestra sobre la zona de aplicación (5) de una membrana (2) del dispositivo según una de las reivindicaciones precedentes 1 a 8, en el que esta muestra se presenta en suficiente cantidad para inducir que el líquido de muestra fluya en dirección de la región de absorción (3) a través de las zonas indicadoras, y para inducir que los analitos o sus derivados en el líquido de muestra formen un complejo en las zonas indicadoras. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que los analitos comprenden en particular antígenos o epítopos de antígenos de grupos sanguíneos A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw y/o K. 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 10, en el que se determinan simultáneamente los analitos antígenos o epítopos de antígenos de grupos sanguíneos A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw y/o K. 12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 11, en el que las partículas indicadoras son eritrocitos. 13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la membrana (2) se lava después de aplicar las partículas indicadoras. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el tampón de lavado es preferentemente hipoosmótico.3 15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 9 a 14, en el que la muestra líquida consiste en sangre o componentes de sangre, preferentemente en sangre completa, concentrado de eritrocitos o líquido de ensayo, tal como sangre de control. - 12 -   FIG. 1 FIG. 2 FIG. 3 - 13 -   FIG. 4 FIG. 5 FIG. 6 FIG. 7 - 14 -   FIG. 8 FIG. 9 FIG. 10 - 15 -   FIG. 11 FIG. 12 FIG. 13 - 16 -   FIG. 14 FIG. 15 - 17 -