GENERACIÓN DE GENES RECOMBINANTES EN SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

Un procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae,

que comprende las etapas de: a) generar en primer lugar células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma una primera casete de recombinación (1) que comprende una primera secuencia de ADN a ser recombinada (A), que está flanqueada al menos por una primera y una segunda secuencias marcadoras y en una posición alélica una segunda casete de recombinación (2) que comprende una segunda secuencia de ADN a ser recombinada (B), que está flanqueada al menos por una tercera y una cuarta secuencias marcadoras, b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obtenidas en a) y c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación (3) en las que las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) están flanqueadas al menos por la primera y la cuarta secuencias marcadoras, y las células haploides que contienen casetes de recombinación (4) en las que las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) están flanqueadas al menos por la segunda y la tercera secuencias marcadoras. etapas de:

La presente invención se refiere en general a métodos para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae y a plásmidos y células de S. cerevisiae utilizados para realizar los métodos de la invención.

Las secuencias de ADN para las que estos métodos son relevantes, incluyen secuencias que codifican proteínas y que no codifican proteínas; pueden consistir también en tramos continuos más grandes que contienen más de una única secuencia codificante con intervención de secuencias no codificantes, tales como aquellas que pueden pertenecer a una ruta biosintética.

La producción microbiana y enzimática de sustancias tales como las enzimas y otras proteínas es un tema económico importante. Las enzimas son proteínas biocatalíticamente activas no solamente responsables del metabolismo de los compuestos y organismos naturales, sino utilizadas también para la producción industrial de compuestos naturales y no naturales. Las enzimas o aquellos compuestos producidos por la ayuda de las enzimas se pueden usar para la producción de fármacos, cosméticos, productos alimenticios, etc. Sin embargo, el uso industrial de las enzimas se ha visto dificultado en gran medida por su especificidad de objetivos y las condiciones específicas en que pueden funcionar. Otras proteínas tienen aplicaciones terapéuticas en los campos de la salud humana y animal. Las clases importantes de proteínas importantes en medicina, incluyen las citoquinas y los factores de crecimiento.

Las proteínas, las enzimas, y las rutas con nuevas o mejores funciones y propiedades se pueden obtener o bien buscando entre las especies naturales en gran parte desconocidas o bien mejorando las proteínas o enzimas naturales actualmente conocidas. El último método puede ser más adecuado para crear propiedades para las que los procesos de evolución natural es improbable que hayan sido seleccionados.

Una estrategia prometedora para crear dichas nuevas propiedades deseables y para rediseñar enzimas, otras proteínas, secuencias o rutas no codificantes es mediante la evolución molecular dirigida. Convencionalmente, cuando se ha alcanzado la evolución directa de las secuencias de ADN con técnicas tales como la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis de multi-sitios o en casete, la mutagénesis al azar, y la PCR propensa a error (error prone PCR). Recientemente, los métodos de transposiciones genéticas para optimizar o ajustar las propiedades de las enzimas o proteínas han atraído mucho la atención. Estas técnicas evolutivas dirigidas pueden producir enzimas que pueden mejorar la tecnología existente, producir nuevos productos y expandir las capacidades de la química sintética.

Existen una serie de diferentes métodos de mutagénesis, tales como la mutagénesis al azar, la mutagénesis dirigida al sitio, la mutagénesis en casete de oligonucleótidos, o la mutagénesis puntual por PCR propensa a error. La mutagénesis al azar, por ejemplo, implica la generación de un gran número de mutaciones de sustitución de nucleótidos distribuidas al azar, en fragmentos de ADN clonado mediante tratamiento con productos químicos tales como ácido nitroso, hidrazina, etc. Se ha desarrollado la PCR propensa a error para introducir mutaciones puntuales al azar en los genes clonados. Las modificaciones que reducen la fidelidad de la reacción de la PCR incluyen el aumento de la concentración de MgCl2, la adición de MnCl2, o la alteración de las concentraciones relativas de los cuatro dNTPs (desoxirribonucleótidos trifosfato).

Estos métodos tradicionales de mutagénesis se enfocan en la optimización de genes individuales que tienen fenotipos diferenciados y seleccionables. La estrategia general es clonar un gen, identificar una función diferenciada para el gen, establecer un ensayo por el cual se pueda monitorizar ésta, mutar las posiciones seleccionadas en el gen y seleccionar las variantes del gen para mejora de la función conocida del gen. Una variante que haya mejorado la función puede ser expresada después en un tipo de célula deseado. Se pueden llevar a cabo ciclos repetitivos de los métodos de mutagénesis para obtener las propiedades enzimáticas deseables.

Cada uno de estos métodos convencionales tiene una estrategia implícita de búsqueda de secuencia. Las estrategias empleadas en las técnicas anteriores de búsqueda de secuencia son muy diferentes. El llevar a cabo una búsqueda de mutagénesis dirigida al sitio de saturación implica un procedimiento de instalación de toda posible permutación en un sitio de interés. Para una proteína, este procedimiento consiste en reemplazar un aminoácido en un sitio de interés con todos los otros 19 aminoácidos y buscar en el banco resultante los mutantes mejorados. En términos de espacio de secuencia esto significa que una región muy pequeña ha sido examinada muy concienzudamente. En comparación, la mutagénesis de casete inserta una secuencia peptídica al azar en una región específica de una proteína, consiguiendo un muestreo menos concienzudo de una región definida más grande, del espacio de secuencia. La PCR propensa a error implica la copia repetida de una secuencia, con la introducción de un número bajo pero significativo de errores. En este caso, se consigue un muestreo escaso de una región menos definida del espacio de secuencia. En cada una de estas estrategias, el mejor mutante obtenido en cada ciclo de selección se usa para iniciar el siguiente ciclo.

Sin embargo, los métodos tradicionales de mutagénesis para desarrollar nuevas propiedades en las enzimas tienen una serie de limitaciones. En primer lugar, sólo son aplicables a genes o secuencias que hayan sido clonados y caracterizados funcionalmente. En segundo lugar, estos métodos usualmente sólo son aplicables a los genes que tienen una función diferenciada. Por tanto, los genes múltiples que confieren cooperativamente un único fenotipo usualmente no se pueden optimizar de esta manera. Finalmente, estos métodos sólo pueden explorar una serie muy limitada del número total de permutaciones, incluso para un solo gen. A la vista de estas limitaciones, los métodos convencionales de mutagénesis son inadecuados para mejorar los genomas celulares con respecto a muchas propiedades útiles. Por ejemplo, las mejoras en la capacidad de una célula para expresar una proteína podrían requerir alteraciones en la eficiencia transcripcional, modificaciones de traducción y post-traducción, secreción o degradación proteolítica de un producto génico. Por lo tanto podría ser necesario modificar genes adicionales que tienen un papel en uno o más de estos mecanismos celulares con el fin de expresar una proteína con nuevas propiedades. El intento de optimizar individualmente todos los genes que tienen dicha función sería una tarea prácticamente imposible.

La mayor parte de los problemas asociados con los métodos convencionales de mutagénesis se pueden resolver mediante métodos de transposiciones genéticas. La transposición genética implica la recombinación al azar de diferentes secuencias de genes funcionales, haciendo posible la mezcla molecular de genes similares a los naturales o mutados al azar. Las transposiciones de ADN o genéticas, o las variaciones de estas técnicas, se han utilizado para mejorar la actividad, estabilidad, plegamiento, y las propiedades de reconocimiento del sustrato de las enzimas. En comparación con los métodos convencionales de mutagénesis con transposiciones genéticas, la probabilidad de obtener mutantes con fenotipo mejorado es significativamente más alta. La transposición genética es fundamentalmente diferente de las estrategias convencionales porque recombina las mutaciones favorables de manera combinatoria. Por tanto examinará regiones mucho más grandes de espacio de secuencia mucho más extendido y con un sesgo hacia la producción de secuencias funcionales. Permite también que mutaciones más beneficiosas procedentes de cada ciclo de selección sean mantenidas en el siguiente ciclo ya que permite que la información de secuencia sea aportada por más de una fuente. Mientras que las estrategias convencionales permiten también la fijación de mutaciones negativas, este no es el caso para los métodos de transposiciones genéticas. Por lo tanto, no es sorprendente que las estrategias de transposiciones genéticas hayan dado resultados mucho más espectaculares.

Las técnicas de transposición de ADN están descritas por Paluh J L et al: "Mutational Analysis of the Gene for Schizosac Caromyces Pombe RNASE MRP, RNA, MRPL, Using Plasmid Shuffle by Counterselection on Canavanine" Yeast,...

1. Un procedimiento para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, que comprende las etapas de:

a) generar en primer lugar células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma una primera casete de recombinación (1) que comprende una primera secuencia de ADN a ser recombinada (A), que está flanqueada al menos por una primera y una segunda secuencias marcadoras y en una posición alélica una segunda casete de recombinación (2) que comprende una segunda secuencia de ADN a ser recombinada (B), que está flanqueada al menos por una tercera y una cuarta secuencias marcadoras,

b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obtenidas en a) y

c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación (3) en las que las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) están flanqueadas al menos por la primera y la cuarta secuencias marcadoras, y las células haploides que contienen casetes de recombinación (4) en las que las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) están flanqueadas al menos por la segunda y la tercera secuencias marcadoras.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

a) generar segundas células diploides mediante el apareamiento de células haploides que contienen las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) obtenidas en 1c) con las células haploides que contienen las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) obtenidas en 1c),

b) inducir la esporulación de las segundas células diploides obtenidas en a) y

c) aislar las células haploides que contienen casetes de recombinación en las que las terceras secuencias de ADN recombinadas están flanqueadas al menos por la primera y la segunda secuencias marcadoras, y las células haploides que contienen las cuartas casetes de recombinación en las que las cuartas secuencias de ADN recombinadas están flanqueadas al menos por la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que se generan secuencias de ADN recombinadas adicionales sometiendo las células haploides obtenidas en 2c) al menos una vez a otro ciclo de apareamiento con otras células haploides, induciendo la esporulación de las células diploides obtenidas y aislando las células haploides con secuencias de ADN recombinadas sobre la base de la unión molecular entre dos secuencias marcadoras.

4. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula diploide se genera transformando simultánea o secuencialmente una célula diploide de S. cerevisiae con una molécula de ADN que contiene la primera casete de recombinación (1) y una molécula de ADN que contiene la segunda casete de recombinación (2) y permitiendo la integración de las dos casetes de recombinación en posiciones alélicas del genoma de S. cerevisiae.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la molécula de ADN que comprende la primera o la segunda casetes de recombinación (1, 2) es un cromosoma artificial de levaduras (YAC).

6. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que la molécula de ADN que comprende la primera o la segunda casetes de recombinación es un vehículo de clonación, por medio del cual las dos secuencias marcadoras respectivas están flanqueadas por secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula diploide se genera por fusión de una célula haploide de S. cerevisiae que lleva en un locus de su genoma la primera casete de recombinación con una célula haploide de S. cerevisiae que lleva en una posición alélica la segunda casete de recombinación.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la primera célula diploide se genera por apareamiento de una célula haploide de

S. cerevisiae que lleva en un locus de su genoma la primera casete de recombinación con una célula haploide de S. cerevisiae que lleva en una posición alélica la segunda casete de recombinación.

9. Un procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que las células haploides que llevan la primera o la segunda casete de recombinación se generan por:

a) insertar la primera secuencia de ADN a ser recombinada entre la primera y la segunda secuencias marcadoras localizadas de forma adyacente sobre un primer vehículo de clonación e insertar la segunda secuencia de ADN a ser recombinada entre la tercera y la cuarta secuencias marcadoras localizadas de forma adyacente sobre un segundo vehículo de clonación, con lo que las dos secuencias marcadoras respectivas son flanqueadas por secuencias de acceso que son homólogas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae,

b) escindir de los vehículos de clonación obtenidos en a) los fragmentos que llevan la primera casete de recombinación (1) y la segunda casete de recombinación (2), respectivamente, con lo que cada una de las casetes comprende la secuencia de ADN a ser recombinada (A, B), flanqueada por las dos secuencias marcadoras respectivas, y cada casete (1, 2) a su vez está flanqueada por secuencias de acceso,

c) transformar los fragmentos que llevan las casetes de recombinación (1,2) con secuencias de acceso flanqueantes obtenidas en b) separadamente en células diploides de S. cerevisiae, con lo que las secuencias de acceso dirigen la integración de las casetes (1,2) hacia aquel locus para el cual son homólogas, con el fin de obtener células diploides heterocigóticas para la primera casete (1), o para la segunda casete (2),

d) inducir por separado la esporulación de las células diploides heterocigóticas obtenidas en c) y

e) aislar las células haploides que contienen la primera casete (1) y que expresan la primera y la segunda secuencias marcadoras y por separado las células haploides que contienen la segunda casete (2) y que expresan la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el primer vehículo de clonación es el plásmido pMXY9 que tiene el número de depósito DSM 17010 y el

segundo vehículo de clonación es el plásmido pMXY12 que tiene el número de depósito DSM 17011.

11. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, 9 o 10, en el que las células diploides de S. cerevisiae usadas para la transformación son auxotróficas al menos para dos factores nutricionales.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que las células diploides son homocigóticas para el alelo ura3-1 y para el alelo trp1-1, lo que las hace auxotróficas para el uracilo y el triptófano, respectivamente.

13. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o 912, en el que las células diploides usadas para la transformación son resistentes al menos a dos antibióticos.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que las células diploides son homocigóticas para el alelo can1-100 y para el alelo cyh2R, lo que las hace resistentes a la canavanina y la cicloheximida, respectivamente.

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o 914, en el que se usan para la transformación células diploides de la cepa MXY47 de S. cerevisiae que tienen el número de depósito DSM 17026, que son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX.

16. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las células de S. cerevisiae tienen un sistema funcional de reparación del apareamiento erróneo.

17. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las células de S. cerevisiae son transitoria o permanentemente deficientes en el sistema de reparación del apareamiento erróneo.

18. Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que la deficiencia transitoria o permanente del sistema de reparación del apareamiento erróneo se debe

a una mutación y/o a una expresión o represión inducible de uno o más genes implicados en el sistema de reparación del apareamiento erróneo, a un tratamiento con un agente que satura el sistema de reparación del apareamiento erróneo y/o a un tratamiento con un agente que globalmente reduce la reparación del apareamiento erróneo.

19. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que la primera (1) y la segunda (2) casetes de recombinación se integran en el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

20. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas (A, B) divergen al menos en 1 nucleótido.

21. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas (A, B) se derivan de organismos distintos de S. cerevisiae.

22. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que la primera y la segunda secuencias de ADN a ser recombinadas (A, B) comprenden una o más secuencias no codificantes y/o una o más secuencias codificantes de proteínas.

23. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que las secuencias marcadoras se seleccionan del grupo que consiste en marcadores nutricionales, marcadores de pigmentos, marcadores de resistencia a antibióticos, marcadores de sensibilidad a antibióticos, sitios de reconocimiento del cebador, límites intrón/exón, secuencias que codifican una subunidad particular de una enzima, secuencias promotoras, secuencias génicas reguladas hacia abajo y sitios de enzimas de restricción.

24. Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que la primera y la tercera secuencias marcadoras son marcadores nutricionales, cuyos productos génicos pueden compensar una auxotrofía de una célula de S. cerevisiae.

25. Un procedimiento según la reivindicación 24, en el que la primera secuencia marcadora es URA3, cuyo producto génico puede conferir prototrofía para el uracilo a una célula de S. cerevisiae auxotrófica para uracilo.

26. Un procedimiento según la reivindicación 24, en el que la tercera secuencia marcadora es TRP1, cuyo producto génico puede conferir prototrofía para el triptófano a una célula de S. cerevisiae auxotrófica para triptófano.

27. Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que la segunda y cuarta secuencias marcadoras son marcadores de sensibilidad a antibióticos, cuyos productos génicos pueden conferir sensibilidad frente a un antibiótico a una célula de

S. cerevisiae que es resistente a dicho antibiótico.

28. Un procedimiento según la reivindicación 27, en el que la segunda secuencia marcadora es CAN1, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad para la canavanina a una célula de S. cerevisiae resistente a la canavanina.

29. Un procedimiento según la reivindicación 27, en el que la cuarta secuencia marcadora es CYH2, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad para la cicloheximida a una célula de S. cerevisiae resistente a la cicloheximida.

30. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que las células haploides que contienen casetes de recombinación con la primera, la segunda, la tercera o la cuarta secuencias de ADN recombinadas se identifican por procedimientos de PCR con el fin de detectar la presencia de la respectiva combinación marcadora.

31. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que las células haploides que contienen casetes de recombinación con la primera, la segunda, la tercera o la cuarta secuencias de ADN recombinadas se identifican poniendo en placas las células haploides en medios que seleccionan la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la respectiva combinación marcadora.

32. Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las primeras secuencias de ADN recombinadas (A/B) se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la primera y la cuarta secuencias marcadoras.

33. Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las segundas secuencias de ADN recombinadas (B/A) se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la segunda y la tercera secuencias marcadoras.

34. Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las terceras secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la primera y la segunda secuencias marcadoras.

35. Un procedimiento según la reivindicación 31, en el que las células haploides que contienen las cuartas secuencias de ADN recombinadas se ponen en placas en un medio que selecciona la unión molecular sobre la misma molécula de ADN de la tercera y la cuarta secuencias marcadoras.

36. El plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010 que comprende de forma adyacente el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1, con lo que las dos secuencias marcadoras flanquean una secuencia con un ligador múltiple para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada y con lo que los dos marcadores están flanqueados por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

37. El plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010, según la reivindicación 36, en el que la secuencia con un ligador múltiple comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción SmaI, XbaI, PacIy BglII.

38. El plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011, que comprende de forma adyacente el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2, con lo que las dos secuencias marcadoras flanquean una secuencia con un ligador múltiple para insertar una secuencia de ADN a ser recombinada (A, B) y con lo que los dos

marcadores están flanqueados por secuencias de acceso homólogas para el locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma III del genoma de S. cerevisiae.

39. El plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011, según la reivindicación 38, en el que la secuencia con un ligador múltiple comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción SmaI, SpeI, y PacI.

40. La cepa MXY47 de S. cerevisiae, número de depósito DSM 17026, caracterizada porque las células diploides de la misma son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX.

41. La cepa JM101 de E. coli, que contiene el plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010.

42. La cepa DH5a de E. coli, que contiene el plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011.

43. Un kit que comprende al menos un primer recipiente que comprende células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, número de depósito DSM 17026, un segundo recipiente que comprende células de la cepa JM101 de E. coli que contienen el plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010, y un tercer recipiente que comprende células de la cepa DH5a de E. coli que contienen el plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011.

44. Un kit que comprende al menos un primer recipiente que comprende células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, número de depósito DSM 17026, un segundo recipiente que comprende el ADN de plásmido pMXY9, número de depósito DSM 17010, y un tercer recipiente que comprende ADN de plásmido pMXY12, número de depósito DSM 17011.