Uso de un ADN de uno cualquiera de los siguientes (i) a (iv) ,

para conferir a una planta de arroz resistencia de campo al añublo: (i) un ADN que codifica un ARN complementario a un producto de transcripción del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2; (ii) un ADN que codifica un ARN que tiene la actividad ribozima para escindir específicamente un producto de transcripción del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2; (iii) un ADN que codifica un ARN que inhibe la expresión del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2 mediante un efecto de cosupresión; y (iv) un ADN que codifica un ARN que tiene actividad iARN para escindir específicamente un producto de transcripción del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2.

Gen Pi21 de susceptibilidad al añublo del arroz y uso del mismo.

Campo técnico

La presente descripción se refiere a pi21, un gen que confiere al arroz resistencia de campo al añublo, y a métodos para modificar la resistencia de campo al añublo en plantas usando el gen.

Técnica anterior

La resistencia del arroz a los hongos del añublo se clasifica en dos tipos: resistencia verdadera y resistencia de campo (documento no de patente 1) . Lo anterior se basa en reacciones de hipersensibilidad, y es una resistencia muy eficaz y cualitativa altamente específica para la raza. Se sabe por experiencia que una variedad a la que se ha introducido un único gen de resistencia pierde su efecto en pocos años debido a la aparición de hongos compatibles con el gen. Por otro lado, la resistencia de campo se define como la diferencia de resistencia entre variedades que se observa en condiciones en las que no está funcionando una resistencia verdadera. Aunque el efecto de resistencia de campo es menor en comparación con la resistencia verdadera, es útil de manera práctica porque tiene baja especificidad de raza y puede conferir resistencia continua a variedades.

Se conocen treinta o más clases de genes asociados con resistencia verdadera, y de éstos, se han aislado los genes Pib y Pita (documento no de patente 2) . Se ha descubierto que estos genes son genes de la clase NBS-LRR que tienen sitios de unión a nucleótidos (NBS) y repeticiones ricas en leucina (LRR) , con estructuras similares a los genes de resistencia a enfermedades de plantas notificados anteriormente. Como otros genes de resistencia a enfermedades, se considera que los productos de genes de resistencia de plantas tienen una función receptora, reconociendo directa o indirectamente productos de genes no patógenos en patógenos correspondientes a las enfermedades. En realidad, se ha revelado que Pita se une física y directamente a un producto génico no patógeno.

En cuanto a la resistencia de campo, se conocen variedades de arroz de secano japonesas que tienen rasgos excelentes, y se han identificado las posiciones cromosómicas de múltiples loci génicos implicados en la resistencia de campo (documento no de patente 3) . Sin embargo, no se han elucidado la estructura y los mecanismos de expresión de los genes, y por tanto, no puede usarse aún de manera eficaz la resistencia de campo para la selección de razas en comparación con la resistencia verdadera. Se ha notificado que múltiples regiones cromosómicas en la variedad de arroz de secano de África Occidental, Moroberekan, desempeñan un papel en la resistencia incompleta, que es un concepto similar a la resistencia de campo (documento no de patente 4) ; sin embargo, no se han identificado genes.

[Documento de patente 1] JP2000093028

[Documento de patente 2] JP2000342262

[Documento de patente 3] JP11299488

[Documento de patente 4] JP2003088379

[Documento de patente 5] JP2003199577

[Documento de patente 6] JP2003199448

[Documento de patente 7] JP2004329215

[Documento no de patente 1] Rice Blast and Breeding for its resistance. Kousaka y Yamazaki eds., págs. 175-186, 1980, Hakuyusha [Documento no de patente 2] Wang et al., Plant J 19:55-64, 1999; Br y an et al. Plant Cell. 12: 2033-46, 2000

[Documento no de patente 3] Fukuoka y Okuno, Theor Appl Genet. 03:185-190, 2001

[Documento no de patente 4] Wang et al., Genet 136:1421-1434, 1994

Descripción de la invención [Problemas que va a resolver la invención]

La presente invención se logró en tales circunstancias. Los problemas que va a resolver la presente invención son aislar e identificar genes implicados en la resistencia de campo al añublo mediante clonación basada en mapa, y proporcionar métodos para modificar resistencia de campo al añublo en plantas usando los genes.

[Medios para resolver los problemas] Se describen genes que controlan la resistencia al añublo en plantas. Se sabía que el alelo pi21 del gen Pi21 confería al arroz (Or y za sativa L.) resistencia de campo al añublo y que existía en alguna posición en la amplia región del cromosoma 4 del arroz. Los presentes inventores tenían como objetivo elucidar la región de existencia y aislar el gen como un único gen.

En primer lugar, los presentes inventores realizaron un análisis de ligamiento detallado de la región de pi21 usando una población de segregación a gran escala indispensable para la clonación basada en mapa, para crear un mapa genético de la región de pi21. Los inventores obtuvieron una población de retrocruzamiento realizando de manera continua el retrocruzamiento de una variedad de arroz con cáscara, Nipponbare o Aichi Asahi, que comprende un alelo de susceptibilidad Pi21 que no suprime la progresión de manchas, con una variedad de arroz de secano japonesa, Owarihatamochi, que comprende un alelo de resistencia pi21 que suprime la progresión de manchas. Cuando se realizó un análisis de ligamiento con marcadores de RFLP para la población de retrocruzamiento obtenida, se confirmó que el locus del gen pi21 está ubicado entre los marcadores de RFLP G271 y G317.

A continuación, usando los marcadores de RFLP RA3591 y 13S1, que están ubicados a cada lado del locus de pi21, los presentes inventores seleccionaron organismos con recombinación cromosómica cerca del locus de pi21 para crear un mapa genético más preciso de la región de pi21. Los presentes inventores también seleccionaron organismos con recombinación cromosómica cerca del locus de pi21, buscando una población F2 obtenida mediante el cruzamiento de una línea que tiene el alelo de resistencia de Owarihatamochi con una línea que tiene el contexto genético de una variedad de arroz con cáscara japonesa y el alelo de susceptibilidad de la variedad de arroz con cáscara india, Kasalath. Como resultado de crear un mapa de ligamiento detallado usando estos organismos y los marcadores de ADN producidos, el locus del gen pi21 resultó estar ubicado en la región genómica de aproximadamente 25 kb intercalada entre el marcador de SSCP Pa102484 y el marcador de SNP P702D3_#12. Además, se determinó la secuencia de nucleótidos de clon de PAC P702D03 que se consideró que incluía el gen pi21. Además, analizando la secuencia de nucleótidos de la región genómica candidata de 25 kb en la variedad resistente Owarihatamochi y las variedades de susceptibilidad Aichi Asahi y Kasalath, se descubrió que el gen pi21 está ubicado en la región genómica de aproximadamente 1, 8 kb intercalada entre los marcadores de SNP P702D03_#38 y P702D03_#80.

Por tanto, los presentes inventores diseñaron cebadores que podían amplificar una parte correspondiente usando la información de la secuencia de nucleótidos ya obtenida de Nipponbare, y luego compararon las secuencias de nucleótidos de los productos genómicos de PCR y RT-PCR entre las variedades de susceptibilidad Nipponbare y Aichi Asahi y la variedad resistente Owarihatamochi. Como resultado, se descubrió que existen dos mutaciones de ADN en la región de exón del gen en la variedad resistente en comparación con las variedades de susceptibilidad. Se demostró que a diferencia de las variedades de susceptibilidad, la variedad resistente tiene deleciones de 7 aminoácidos y 16 aminoácidos, y que estas mutaciones se relacionan con la progresión de manchas producida por la infección de añublo. Es decir, el gen pi21 controla la resistencia al añublo de la planta. Se proporcionan además:

[1] un ADN de uno cualquiera de los siguientes (a) a (h) :

(a) un ADN que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 22,

(b) un ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 2, 20, ó 21,

(c) un ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con una sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 22, y que tiene una función equivalente a la de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 22,

(d) un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, 2, 20 ó 21, y que codifica una proteína que tiene una función equivalente a la de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ó 22,

(e) un ADN que codifica una proteína que comprende la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Uso de un ADN de uno cualquiera de los siguientes (i) a (iv) , para conferir a una planta de arroz resistencia de campo al añublo:

(i) un ADN que codifica un ARN complementario a un producto de transcripción del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2;

(ii) un ADN que codifica un ARN que tiene la actividad ribozima para escindir específicamente un producto de transcripción del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2;

(iii) un ADN que codifica un ARN que inhibe la expresión del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2 mediante un efecto de cosupresión; y (iv) un ADN que codifica un ARN que tiene actividad iARN para escindir específicamente un producto de transcripción del ADN que comprende una región codificante de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 2.

2. Un vector que comprende el ADN de uno cualquiera de (i) , (ii) y (iv) de la reivindicación 1.

3. Una célula transformada que comprende el ADN de uno cualquiera de (i) , (ii) y (iv) de la reivindicación 1.

4. Una célula vegetal transformada que comprende el ADN de uno cualquiera de (i) , (ii) y (iv) de la reivindicación 1.

5. Una planta transformada que comprende la célula transformada de la reivindicación 4.

6. Una planta transformada que es una progenie o clon de la planta transformada de la reivindicación 5, en la que dicha progenie o clon comprende el ADN de uno cualquiera de (i) , (ii) y (iv) de la reivindicación 1.

7. Un material de propagación de la planta transformada de la reivindicación 5 ó 6, comprendiendo dicho material de propagación el ADN de uno cualquiera de (i) , (ii) y (iv) de la reivindicación 1.

8. Un método para producir la planta transformada de la reivindicación 5 ó 6, que comprende la etapa de introducir en una célula vegetal el ADN de uno cualquiera de (i) , (ii) y (iv) de la reivindicación 1, y luego regenerar una planta a partir de la célula vegetal.

9. Un método para conferir a una planta resistencia de campo al añublo, que comprende la etapa de expresar el ADN de la reivindicación 1 en una célula de la planta.

AICHI ASAHI

FIG 3